$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: שואפי מח עצם של כלבים מסמל האיליאק נאספו בהסכמת בעל הכלב. שואפי מח עצם לכלבים (כ-10 מ"ל) היו נוגדי קרישה על ידי תוספת של 15 מ"ל של 3.8% נתרן ציטראט מיד לאחר הגמילה בחדר הניתוח. הדגימות הועברו לסביבת המעבדה לעיבוד באותו יום שבו הוצאו.
1. הכנת אורוקינאז (לפני שימושראשון)
- יש לשחזר אורוקינאז באמצעות מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) בהתאם להוראות היצרן: יש להוסיף 10 מ"ל PBS לבקבוק כניסת המחיצה באמצעות מזרק של 10 מ"ל. יש להמיס את החומר היבש על ידי ערבול לקבלת 50,000 יחידות הזרקה (U) למ"ל.
- הכינו 500 μl aliquots (25,000 U כל אחד) לתוך צינורות סטריליים. לאחסן aliquots -20 °C ומשתמש בו בעת הצורך לפחות 6 חודשים.
2. שלבי הכנה (לפני כל טיפול במח עצם)
- הפשיר אליקוט אחד של אורוקינאז (25,000 U) לכל מח עצם קרוש aspirate (נפחי שאיפה עד 25 מ"ל טופלו בהצלחה באמצעות aliquot יחיד של 25,000 U).
- מחממים מראש אמבט מים או אינקובטור רועד ל 37 מעלות צלזיוס.
3. עיכול אנזימטי של הקריש
- בצע את כל העבודה בארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי של דגימות מח העצם במהלך העיבוד. כאשר עובדים עם חומר אנושי שעלול להיות מדבק, מומלץ להשתמש בכפפות מגן, כמו גם טיפול זהיר.
- מניחים מסננת תאים בגודל 100 מיקרומטר על גבי צינור סטרילי של 50 מ"ל. בזהירות לשפוך את מוח העצם לשאוף דרך מסננת התא, להטות את המסננת או לנוע סביב חומר הקריש. השתמש בקצה פיפט סטרילי לזרימה טובה יותר דרך רשת המסנן.
הערה: הימנע מכל דילול של הקריש, למשל, על ידי שטיפת הקריש עם PBS. אורוקינאז פועל בעקיפין ודורש רכיבים של הסרום (כלומר, פלסמינוגן) מהביופסיה לעיכול יעיל. תוך כדי המשך ההליך עם חומר הקריש, ניתן לשמור את התסנין ב- RT עד לשימוש נוסף בשלב 3.6.
- מעבירים את חומר קריש מח העצם לצלחת תרבית תאים ריקה באמצעות מלקחיים סטריליים. חותכים את הפסולת לחתיכות קטנות של כ 2 מ"מ3 באמצעות אזמל סטרילי.
- מעבירים את החתיכות הקטנות של הקריש לתוך צינור תגובה של 50 מ"ל באמצעות המלקחיים הסטריליים. ודא כי קריש טחון יש מראה רטוב. אם נראה שהוא יבש, השתמשו בחלק מהתסנין משלב 3.1 כדי להרלח.
- נטרפו את הקריש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה במשך 5 פעמים באמצעות צינור מיקרוטיטר 5 מ"ל. הוסף 1 aliquot של urokinase לדגימה. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C באמבט מים או באינקובטור מטלטל (בעדינות).
- טרטוראט על ידי פיפטינג למעלה ולמטה במשך 5 פעמים באמצעות פיפט 5 מ"ל. בצע שלב זה בארון בטיחות ביולוגית. יש לדגור במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 37°C. לאחר הדגירה, triturate שוב 5 פעמים באמצעות פיפט 5 מ"ל. מעבירים מסננת תאים טרייה של 100 מיקרומטר למאגר עם התסנין משלב 3.2.
- צנטריפוגה את מתלה התא בטמפרטורת הסביבה למשך 10 דקות ב 500 x גרם. יש להשליך את הסופרנטנט. השהה מחדש את גלולת התא במדיה כמתואר להלן או בהתאם לנוהל הסטנדרטי של המעבדה שלך לתרבית הרחבה של MSC.
4. זריעה להרחבת תרבית תאים וצלחות CFU
- להשהות מחדש את התאים (המורכבים מאריתרוציטים ותאים חד-גרעיניים) ב-50 מ"ל של מדיום בסיסי: אלפא-MEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ו-2.5 מ"ג/מ"ל אמפוטריצין B. ספרו את התאים המדוללים ביחס 1:10 בתמיסת Trypan Blue באמצעות תא נויבאואר.
- צלחת התאים בצלוחיות תרבית תאים בצפיפות של 5 x 107 תאים / ס"מ2 ולדגור באינקובטור לח ב 37 ° C. במידת האפשר, יש להשתמש בתנאים היפוקסיים (5% חמצן). עבור בקרת בדיקת CFU, צלחת 109 תאים בצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ.
- לאחר 3 ימים של תרבית, תאי גזע מזנכימליים מחוברים לצלחת תרבית התאים בעוד תאים אחרים נשארים בהשעיה. יש להחליף את המדיה בתווך בסיסי בתוספת גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF) של 5 נ"ג/מ"ל. עבור בקרת בדיקת CFU, התייחס גם לצלחת תרבית התא.
- המשך תרבית תאים במשך 2 שבועות בסך הכל, החלפת מדיה שלוש פעמים בשבוע. אם התאים עולים על 80% מפגש, פיצול על ידי טריפסיניזציה. עבור בקרת בדיקת CFU, להחליף את המדיה באופן דומה, אבל לא לפצל את התאים במשך השבועיים.
5. בידול MSC
- הכלב MSCs differentiation
הערה: MSCs כלבים נבדלו לשושלות כונדרוגניות, אוסטאוגניות ואדיפוגניות על ידי גירוי עם המדיה המתאימה במשך ארבעה שבועות.
- התמיינות כונדרוגנית
- קוביות חתוכות (3 מ"מ לכל צד) ממכשיר רפואי בצורת ספוג, המורכב מקולגן מסוג I שעבר ליופיליזציה, ומשמש כחומר פיגום לתמיכה בתאים.
- זרעים MSCs בחלק העליון של הקוביות בריכוז של 4 x 106 תאים / ml (~ 70,000 תאים / קובייה).
- לפני הוספת מדיה, לאפשר לתאים להיצמד לקוביות במשך 30 דקות.
- לשמור על מבני MSC-קולגן במדיה כונדרוגנית המורכבת מ-DMEM/F12 + GlutaMAX, 2.5% FBS, 100 יחידות/מ"ל פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 40 נ"ג/מ"ל דקסמתזון, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית 2-פוספט, 50 מיקרוגרם/מ"ל L-פרולין, 1x אינסולין-טרנספרין-סלניום X ו-10 נ"ג/מ"ל גורם גדילה-β1.
- השתמש צביעה כחולה alcian כדי לדמיין הצטברות של proteoglycans בחלקים מבנים. בקצרה, הכתימו את החלקים O/N עם 0.4% כחול אלקיאני מומס ב 0.01% H2SO4 ו 0.5M guanidine hydrochloride. לאחר מכן, לשטוף את החלקים נשטפו במשך 30 דקות ב 40% DMSO ו 0.05M MgCl2. התאים הוכתמו באדום גרעיני מהיר.