צביעת סודן IV: הליך להכתמת רבדים טרשתיים עמוסי שומנים בקשת אבי העורקים של עכבר שנקטף

תקציר

מקור: Centa, M., et al. כימות טרשת עורקים בעכברים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים הליך באמצעות כתם סודן IV להכתמת משקעי השומן בקשת אבי העורקים של העכבר שנקטף כדי להמחיש את הפלאק הטרשתי ולקבוע את היקף טרשת העורקים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE

1. ניתוח פנים של קשת אבי העורקים ועורק ברכיוצפלי

1. הכינו מיטות הצמדה לניתוח פנים של קשתות אבי העורקים. קפלו קטע של סרט שעוות פרפין שמונה פעמים ליצירת משטח שטוח בגודל 25 מ"מ x 25 מ"מ. עטפו אותו בסרט בידוד חשמלי שחור כדי ליצור רקע כהה לאבי העורקים. הניחו תווית על הצד האחורי של מיטת ההצמדה והשתמשו בעיפרון עופרת כדי לכתוב את מספר הזיהוי של העכבר (דיו עט רגיל ייעלם בתהליך הצביעה).
2. מעבירים את קשת אבי העורקים למיטת ההצמדה ומניחים עליה טיפה של PBS. התחל לנקות את אבי העורקים מרקמת השומן הפריאדוונטית שנותרה תחת סטריאומיקרוסקופ.
   1. השתמש במספריים של Vannas ומלקחיים של Dumont כדי לקלף בעדינות את כל רקמת השומן שמסביב מבלי לטפל או לפגוע באבי העורקים. סודן IV יכתים את רקמת השומן בבהירות וחיוני להסיר את כל הרקמה הזו בשלב זה.
      הערה: שמור על לחות אבי העורקים בכל עת, החל PBS נוסף בעת הצורך.
3. פתח את אבי העורקים במישור העטרה על ידי החדרת מספריים Vannas בלומן אבי העורקים כדי לחשוף את פני השטח האינטימיים. מתחילים לחתוך את העקמומיות החיצונית של הקשת העולה בכיוון דיסטלי וממשיכים לחתוך את הענפים כולל העורק הברכיוצפלי. חוסכים את החלק הגבי של אזור בית החזה היורד.
   1. פתח את העקמומיות הקטנה יותר וקפל את אבי העורקים כדי להציג את המשטח האינטימי.
      הערה: שלב זה דורש מיומנויות מוטוריות עדינות וצריך קצת תרגול כדי לשלוט.
4. הצמידו את הקשת הפתוחה למצע ההצמדה בעזרת הקצה הקהה של סיכות חרקים זעירות. השתמש במחזיק מחט מיקרו Castroviejo כדי לשים את הפינים במקומם. כופפו בעדינות את הפינים הרחק מהדגימה כשהם במקומם. נעצו את אבי העורקים שטוח על המיטה מבלי למתוח את הדגימה. אחסנו את הקשת המוצמדת הפונה כלפי מטה בצלחת פטרי מלאה PBS בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
5. הכינו פתרון עבודה של סודן IV. יש לערבב גרם אחד של אבקת Sudan IV, 100 מ"ל של 70% אתנול ו-100 מ"ל אצטון בבקבוק כהה ולערבב בעדינות במשך 10 דקות. אין צורך לסנן את התמיסה וניתן להשתמש בה במשך מספר חודשים אם שומרים עליה כהה בטמפרטורת החדר. אם צבע הכתם אינו משביע רצון, ניתן ליצור פתרון חדש ולהכתים את הדגימות שוב.
   זהירות: אצטון הוא נוזל דליק שעלול לגרום לגירוי חמור בעיניים. יש לאחסן במקום מאוורר היטב ולנקוט אמצעי זהירות בעת הטיפול.
6. סדרו חמש צלחות פטרי על ספסל המעבדה: אחת מלאה באתנול 70%, אחת מלאה בתמיסת עבודה סודן IV, שתיים מלאות באתנול 80% ואחת מלאה PBS.
   1. התחילו בשטיפת הדגימה באתנול 70% במשך 5 דקות על ידי הנחת מצע הנעיצה בצלחת הפטרי הראשונה כשהקשת פונה כלפי מטה. העבירו את הדגימה לתמיסת העבודה סודן IV ותנו לה להכתים את הקשת למשך 7 דקות.
   2. לאחר מכן, שטפו באתנול 80% במשך 3 דקות פעמיים כדי להכתים את המשטח האינטימי הרגיל. ניתן לכוונן את זמן העיכוב כדי למטב את התוצאות. לבסוף, שטפו ב-PBS לפני שתחזירו את הדגימה לצלחת הפטרי המקורית.
7. רכשו מיקרוגרפים באמצעות סטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 המחובר למצלמה דיגיטלית. צלמו את הקשת המוצמדת שקועה ב-PBS באמצעות משקולות מתכת קטנות (20 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ) כדי להחזיק את מצע ההצמדה לתחתית צלחת פטרי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרט בידוד חשמלי שחור (ברוחב 50 מ"מ)	כל קמעונאי מתמחה		ליצירת מיטות הצמדה לקשתות אבי העורקים.
מספריים מנתחים (10 ס"מ, ישר)	מכשירים מדויקים בעולם	14393	לדיסקציה כללית של איברים.
מלקחיים Dumont #5 (11 ס"מ, ישר)	מכשירים מדויקים בעולם	500341	עבור microdissection של אבי העורקים.
אתנול 70% (v/v)	VWR כימיקלים	83801.29	נוזל ואדים דליקים במיוחד, יש לאחסן במקום מאוורר היטב ולהתקרר.
אתנול מוחלט ≥99.8%	VWR כימיקלים	20821.31	נוזל ואדים דליקים במיוחד, יש לאחסן במקום מאוורר היטב ולהתקרר.
פורמלדהיד 4% מיוצב, חוצץ (pH 7.0)	VWR כימיקלים	9713.1	מזיק בשאיפה, במגע עם העור ואם נבלע.
איזופרופנול	מרק	1096341011	נוזל דליק, גורם לגירוי חמור בעיניים, ועלול לגרום לנמנום או סחרחורת.
מחזיק מחט Micro Castroviejo (9 ס"מ, ישר)	מכשירים מדויקים בעולם	503376	להצמדת קשתות אבי העורקים.
סיכות חרקים זעירות, 0.10 מ"מ	כלים מדעיים משובחים	26002-10	להצמדת קשתות אבי העורקים.
פארפילם מ	במיס	PM992	סרט שעווה פרפין המשמש ליצירת מיטות הצמדה לקשתות אבי העורקים.
מלח חוצץ פוספט (PBS)	-	-	פתרון סטרילי ונטול RNase נדרש עבור זילוח של עכברים
סטריאומיקרוסקופ	לייקה מיקרוסיסטמס	MZ6	לדיסקציה ותיעוד פנים
סודאן IV	סיגמא-אולדריץ'	S4261	אינו מסווג כחומר מסוכן או תערובת.
מספריים Vannas (8 ס"מ, ישר)	מכשירים מדויקים בעולם	503378	עבור microdissection של אבי העורקים.