צביעת ויזנר להדמיית ליגנין: טכניקה להכתמת משקעי ליגנין הנמצאים בגבעולים של Arabidopsis thaliana

תקציר

מקור: Pradhan Mitra, P. et al., צביעה היסטוכימית של Arabidopsis thaliana אלמנטים דופן התא המשני. J. Vis. Exp. (2014).

בסרטון זה אנו מתארים את טכניקת הצביעה של ויזנר להכתמת הליגנין הקיים בתאי צמח מיוחדים. טכניקת צביעה זו מסייעת לדמיין את דפנות התא המיושרות בגבעולי Arabidopsis thaliana ומסייעת לכמת את הליגניפיקציה בדפנות התא של סוגים שונים של תאים.

פרוטוקול

1. שיבוץ גזע

1. הכינו תמיסת אגרוז 7% במים (7 גרם אגרוז בדרגת אלקטרופורזה במים מזוקקים של 100 מ"ל). יש להמיס את האגרוז על ידי אוטוקלאבינג למשך 20 דקות או על ידי גלי מיקרו למשך 20 דקות בעוצמה הנמוכה ביותר (למשל, עוצמה של 10% של מיקרוגל של 1,250 וואט).
2. מכינים תבנית ביתית להטמעת הגבעולים באמצעות בקבוקוני פלסטיק.
   1. באמצעות סכין גילוח, חתכו את התחתית החרוטית של צינור מיקרוצנטריפוגה בעל מכסה בורג של 2 מ"ל (חלק A). בעזרת מחט מזרק, נקבו חור במכסה הצינור מעט גדול מקוטר הגבעול שיש להטביע. לאחר מכן, לחתוך 0.5 ס"מ מהתחתית של צינור מיקרוצנטריפוגה 0.6 מ"ל (חלק B).
   2. הוסף את החלק החתוך 0.5 ס"מ של צינור מיקרוצנטריפוגה 0.6 מ"ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל חתוך מראש. אטמו את שני החלקים באמצעות Parafilm (איור 1).
      הערה: החלק התחתון של הצינור נחתך כדי להקל על הסרת הדגימה המשובצת לאחר האגרוז התמצק. החור בכובע יסייע להחזיק את הגבעול יציב כאשר הגבעול מוטבע באגרוז. התבנית תשמש להחזיק את האגרוז ולהחזיק את הגבעול ישר בעת ההטבעה. הפרפילם יחזיק את שני החלקים, A ו-B, עד לקיבוע האגרוז ולהטמעת הגבעול.
   3. באמצעות סכין גילוח, חתכו קטע גזע מאזור העניין (למשל אמצע צומת הגבעול הראשון).
      הערה: באופן אידיאלי, יש לחתוך את הגבעול ממש לפני ההטבעה כדי למנוע הרס על ידי התייבשות. לחלופין, ניתן לאחסן את הגבעול באופן זמני בצלחת המכילה נייר סינון רטוב במים. ניתן להניח צלחת זו על קרח עד שהיא מוכנה להטמעה כדי למנוע התייבשות ועיוות של רקמות. אחסון הגבעול לפרקי זמן ארוכים מ-30 דקות ללא לחות גבוהה יגרום לגבעול להתייבש.
3. ממיסים את האגרוז במיקרוגל בעוצמה נמוכה.
   זהירות: הבקבוק המכיל אגרוז עשוי להיות חם. השתמש בכפפה כדי להרים את הבקבוק. תן agarose מומס לעמוד בטמפרטורת החדר (בין 20 ° C ו 25 ° C) עד שהוא מתקרר כ 50 ° C.
4. לאט פיפטה 5 מ"ל של agarose לתוך תבנית פלסטיק מוכן מראש למלא את בקבוקון.
   הערה: ודאו שאין בועות אוויר בתבניות. בועות אוויר יגרמו לרווחים בתבנית האגרוז ולא יכסו לחלוטין את דגימת הגבעול, מה שיוביל בסופו של דבר לחיתוך לא אחיד של חלקי הדגימה.
   1. תנו לאגרוז להתקרר למשך 30 עד 60 שניות כדי להפוך למוצק למחצה. בדוק עם קיסם קטן, לוודא שהוא יכול לחדור ולעמוד, אבל לא לצוף, באגרוז.
      הערה: אם הגבעול ממוקם כאשר האגרוז עדיין חם הוא יפגע בדגימה על ידי כיווץ הגבעול, והורס את המורפולוגיה של התא.
   2. מניחים את הגבעול בבקבוקון מלא אגרוס זה. ודא כי הגבעול נשאר ישר. מניחים את הכובע המחורר כך שקצה הגבעול מוחזק על ידי הכובע. אין לסובב את מכסה ההברגה. לפעמים יותר מגבעול אחד (מסוג אחד) יכול להיות משובץ בבקבוקון אחד; אבל במקרה כזה, אל תשתמש ב- cap.
      הערה: אם מסובבים את מכסה ההברגה, הגבעול יתעקם.
5. השאירו את הבקבוקון בטמפרטורת החדר או ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10-30 דקות, עד שהוא מתמצק.
6. הסירו את התבנית על ידי החלקתה בעדינות אל מחוץ לצינור. פתח את Parafilm. דחפו את החלק התחתון של חלק B של התבנית בעדינות עם האגודל כדי לשחרר את האגרוז המוצק מחלק A אל מגלשת מיקרוסקופ זכוכית.
7. חותכים את הגבעול המשובץ אגרוז לשלוש חתיכות שוות בערך באורך 1.2 ס"מ. חותכים את החלק של הגבעול שלא היה באגרוז ומשליכים אותו.
   1. אחסנו את חתיכות האגרוז האלה עם הגבעולים המשובצים בצינורות מיקרוצנטריפוגות אטומים של 2 מ"ל בקופסה חשוכה בטמפרטורה של 4°C עד שהם מוכנים לחתך. לחלופין, יש לאחסן את הצינורות בטמפרטורה של 4°C למשך שבוע לכל היותר.
      הערה: אחסון אפשרי, אבל הנסיין צריך להיות מודע לכך שהגבעולים המשובצים עדיין חיים, ובהתאם לניסוי, ממצאים עשויים להיות מוצגים.

2. חתך גזע

זהירות: יש לקרוא בעיון את מדריך הוויברטום ולעקוב אחר כל הוראות הבטיחות.

1. ודא שדיסק הדגימה נקי ויבש לחלוטין (ללא מוצק או נוזל). נקו את דיסק הדגימה עם סכין גילוח כדי להסיר שאריות דבק מניסויים קודמים ושטפו במים. לאחר מכן יבש עם מגבת נייר.
   הערה: זה יבטיח כי הדבק עובד היטב ונקשר לדגימת האגרוז. אם שלב זה לא נעשה כראוי, ייתכן שהדגימה לא תיצמד לדיסק ומאוחר יותר תגרום לדגימה ליפול מהדיסק במהלך החיתוך.
   1. השתמשו במגבוני נייר רכים כדי להסיר לחות מגוש האגרוז המכיל את הדגימות.
   2. הניחו טיפה קטנה של דבק טישו על דיסק הדגימה. פזרו את הדבק כדי לכסות את האזור במרכז הצלחת בעזרת קצה בקבוק ההדבקה. מקם במהירות את בלוק האגרוז כך שהדגימות יהיו בניצב או במקביל ללוח עבור חתכים רוחביים או אורכיים, בהתאמה. אפשרו לדבק לקבע את הדגימה לדיסק הדגימה בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של 4°C למשך 10-30 דקות. הערה: זהו שלב תלוי זמן.
2. תקן את דיסק הדגימה במקומו על מגש המאגר או השוקת. הבלוק / ים של agarose עם החלקים צריך להיות במקביל סכין גילוח. ממלאים את מגש החיץ במים מזוקקים בטמפרטורת החדר עד שהדגימות שקועות לחלוטין.
3. חותכים סכין גילוח לשניים ואז חותכים את הקצוות עם מספריים קשיחים כך שהלהב נשאר שטוח לחלוטין. חברו מחצית מסכין הגילוח החתוך מראש למחזיק הסכין.
   1. כוונו את הזווית על מחזיק הסכין ל-84°, את המהירות ל-0.90 מ"מ/שנייה (מיקום 8 בוויברטום) ואת התדר ל-50 הרץ (מיקום 5 בוויברטום). חותכים חלקים בעובי 100 מיקרומטר. השתמש במצב רציף. הערה: עובי זה נבחר כדי להבטיח שהרקמה תוכל לעמוד בטיפולי החומצה והבסיס השונים המשמשים בחלק מפרוטוקולי הצביעה. הגדר את החלון לחתך ואפשר 15-20 דקות במצב רציף עבור הוויברטום לחתוך גוש אגרוז של כ 1.2 ס"מ.
4. אספו את המקטעים באמצעות פיפטת פלסטיק חד פעמית במהלך החתך במגש החיץ. לחלופין, ניתן להעביר את החלקים ממגש החיץ לתוך זכוכית ולאחר מכן לצלחת פטרי שקופה. מעבירים כמה חלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 2.0 מ"ל. הערה: הדגימות נאספות מצלחת פטרי מכיוון שקל יותר לראות את החלקים על רקע ברור, ומכיוון שניתן להכין את מגש החיץ לדגימה הבאה.
5. ניתן לאחסן את החלקים בצינור של 50 מ"ל או לאסוף ולאחסן בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 עד 2 מ"ל ב -4 ° C למשך 30 עד 60 דקות.
   הערה: אחסון המקטעים לפרקי זמן ארוכים יותר יגרום לאיכות תמונה ירודה.

3. צביעת Phloroglucinol-HCl (ויזנר)

1. להמיס 0.3 גרם של phloroglucinol ב 10 מ"ל אתנול מוחלט להכין פתרון phloroglucinol 3%. ערבבו נפח אחד של HCl מרוכז (37 N) לשני כרכים של 3% פלורוגלוצינול באתנול; פתרון זה הוא phloroglucinol-HCl (Ph-HCl) או Wiesner stain.
   הערה: תמיסה זו צריכה להיות טרייה ביום הצביעה ולא ניתן לאחסן אותה, מכיוון שהתמיסה תתפרק עם הזמן והצביעה תהפוך ללא יעילה.
   זהירות: HCl הוא חומר מאכל מאוד, לכן יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול בכתם Ph-HCl.
2. מעבירים את קטעי הגבעול לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2.0 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת Ph-HCl לצינור המכיל את החלקים וסגור אותו מיד מכיוון שה- HCl בכתם Ph-HCl הוא קורוזיבי מאוד. הזיזו בעדינות את הצינור כדי לוודא שכל החלקים מוכתמים. חלופה לשלב זה היא לשמור על מכסה הצינור פתוח, כך שניתן יהיה להעלות ולהוריד את תמיסת Ph-HCl, רצוי מבלי להפריע לסעיפים.
   הערה: היזהרו לא להכניס את המקטעים לקצה הפיפטה, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בחלקים אלה.
   1. השתמש פיפטה 1 מ"ל עם קצה פיפטה לחתוך בצורה כזו כי חלקים ניתן pipeted החוצה בקלות ללא נזק. מקטעים פיפטה בעדינות לתוך הקצה ועל מגלשת מיקרוסקופ. כסו את המקטעים בפתק כיסוי. התבונן במקטעים תחת תאורת שדה בהיר. (איור 2)
      הערה: תמיסת Ph-HCl מתייבשת תוך 5-10 דקות, וגורמת להידרדרות הדגימות. לכן, יש להשלים את ההדמיה בתוך פרק זמן זה.

תוצאות

איור 1. תבנית ביתית להטמעת הגבעולים.בצד שמאל; החלק העליון של צינור מיקרוצנטריפוגה עם מכסה בורג של 2 מ"ל (חלק A) והחלק התחתון של צינור מיקרוצנטריפוגה של 0.6 מ"ל (חלק B). בצד ימין; הפרפילם מחזיק את שני החלקים; A ו- B כדי ליצור את התבנית הסופית.

איור 2. צביעת פלורוגלוצינול-HCl של חתכי גזע A. thaliana . צביעת פל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	EMD	MERC2125	מספר CAS: 9012-36-6
פלורוגלוצינול	סיגמא	עמ' 3502	1,3,5-trihydroxybenzene [מספר CAS: 108-73-6]
חומצה הידרוכלורית	EMD	HX0603-75	מספר CAS: 7647-01-0
אתנול 190 הוכחה	קופטק	V1401	מספר CAS: 64-17-5
ויברטומה	לייקה	מיקרוטום להב רוטט של Leica VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ מוצרים/חתך/רטט-מיקרוטומים/פרטים/מוצר/ LEICA-VT1000-S/
תער	חברת סכיני הגילוח American Safety	פריט # 60-0139-0000	להב קצה כפול מפלדת אל-חלד (Personna Super)
פקק בורג צינורות מיקרוצנטריפוגות (2 מ"ל)	VWR	16466-044
צינורות מיקרוצנטריפוגות (0.6 מ"ל)	Axygen סיינטיפיק	MCT-060-C
דבק רקמות	טד פלה בע"מ	10033	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C או 20°C למשך 3 חודשים או יותר לאחסון
מצלמה עם שבב CCD ללא תריס מכני	האמאמאטסו	C4742-95
תוכנת מצלמה	התקנים מולקולריים	MetaMorph גרסה 7.7.0.0
לדמיין אנליזה	אדובי	פוטושופ CS4
משקפי מיקרו כיסוי, מרובע, מס' 1	VWR	48366-067	22 x 22 מ"מ (7/8 x 7/8 אינץ')-כוסות כיסוי עמידות בפני קורוזיה
מגלשות מיקרו חלביות, 1 מ"מ	VWR	48312-003	75 x 25 מ"מ - 1 מ"מ