צביעת מאולה לליגנין: טכניקה לאפיון התפלגות ליגנין בקטעי גזע Arabidopsis thaliana

תקציר

מקור: Pradhan Mitra, P. et al., צביעה היסטוכימית של Arabidopsis thaliana אלמנטים דופן התא המשני. J. Vis. Exp. (2014).

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת הצביעה של Maule להכתמת ליגנין מזרק הקיים בתאי הצמח המתמחים. טכניקת צביעה זו מסייעת לאפיין את התפלגות הליגנין בסיבים הקסילם והאינטרפשקולריים.

פרוטוקול

1. צביעת Mäule

1. ממיסים 0.2 גרם אשלגן פרמנגנט במים מזוקקים של 40 מ"ל להכנת תמיסת אשלגן פרמנגנט 0.5%. יש לאחסן בבקבוק כהה בטמפרטורת החדר למשך 7 ימים לכל היותר.
   1. הכינו תמיסת HCl של 3.7% על ידי הוספת 1 מ"ל HCl מרוכז (37 N) ל-9 מ"ל מים מזוקקים (1:10). הכינו תמיסה טרייה של 3.7% HCl ביום הניסוי. ודא כי פתרון המניות 37 N HCl בשימוש אינו ישן מדי. תמיסת אמוניום הידרוקסיד מרוכזת (14.8 מ ') צריכה להיות מאוחסנת ב -4 מעלות צלזיוס כדי למנוע את הטוחנות של התמיסה הרוויה מלרדת.
2. מעבירים את קטעי הגבעול לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2.0 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת פרמנגנט אשלגן 0.5% לצינור המכיל את הסעיפים.
   1. פיפטה את תמיסת פרמנגנט אשלגן 0.5% למעלה ולמטה בעדינות, רצוי מבלי להפריע את הסעיפים. דוגרים במשך 2 דקות וחוזרים על הפיטינג. תן לצינור המיקרוצנטריפוגה לעמוד עד שכל החלקים יירגעו.
      הערה: היזהרו לא להכניס את המקטעים לקצה הפיפטה, שכן החלקים עלולים להיפגע. ייתכן שיהיה קשה לראות את חלקי הגבעול מכיוון שהתמיסה כהה, לכן שמור את המבחנה עם החלקים על מדף המבחנה ואפשר להם להסתפק במשך 2 דקות.
   2. באמצעות פיפטה 1 מ"ל, לצייר 700 μl של 0.5% אשלגן permanganate פתרון. הוסף 700 μl של מים מזוקקים כדי לשטוף את תמיסת permanganate אשלגן. יש לחזור על הפעולה 3-4 פעמים או עד שתמיסת המים נשארת צלולה.
   3. השליכו את המים. הוסיפו במהירות 1 מ"ל של 3% HCl עד שהצבע החום העמוק משתחרר מהסעיפים. זה יכול לקרות תוך 3-5 דקות או עשוי לדרוש 2 שטיפות של 5 דקות כל אחת. פיפטה החוצה את כל פתרון HCl 3% ומיד להמשיך לשלב הבא.
   4. הוסף 1 מ"ל של תמיסת אמוניום הידרוקסיד מרוכזת. השתמש פיפטה 1 מ"ל עם קצה לחתוך בצורה כזו את החלקים ניתן pipeted החוצה בקלות ללא נזק. מקטעים פיפטה בעדינות לתוך הקצה ועל מגלשת מיקרוסקופ. כסו את המקטעים בתלוש כיסוי. התבונן במקטעים תחת תאורת שדה בהיר. (איור 1)
      זהירות: מכיוון שאמוניום הידרוקסיד הוא קורוזיבי ביותר, הוא דורש טיפול ותשומת לב נוספים כדי למנוע גרימת קורוזיה לשלב המיקרוסקופ או העדשה.
      הערה: אדי האמוניום הידרוקסיד יכולים לערפל את הכיסוי, מה שמקשה על צפייה בדגימה. לכן, יש לנקוט משנה זהירות לפני הוספת הכיסוי. התמיסה מתייבשת תוך 5-10 דקות, ולכן יש להשלים את ההדמיה בתוך פרק זמן זה.

תוצאות

איור 1. צביעת Mäule של חתכי גזע A. thaliana . צביעת Mäule (צבע אדום) של חתך גזע פראי מסוג A. thaliana המראה את שקיעת הליגנין הרגילה בדפנות הסיבים הבין-פשיקולריים ותאי הקסילם (A-E). המיקומים של האפידרמיס וקליפת המוח (Ep), סיבים בין-פשיקולריים (Fi), פית (Pi) וקסילם (Xy) מסומנים. הגדלות: לוח A: 5X; לוח B: פי 10; לוח C: פי 20; לוחות D ו-E: 40X. בר = 100 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	EMD	MERC2125	מספר CAS: 9012-36-6
חומצה הידרוכלורית	EMD	HX0603-75	מספר CAS: 7647-01-0
ויברטומה	לייקה	מיקרוטום להב רוטט של Leica VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ מוצרים/חתך/רטט-מיקרוטומים/פרטים/מוצר/ LEICA-VT1000-S/
תער	חברת סכיני הגילוח American Safety	פריט # 60-0139-0000	להב קצה כפול מפלדת אל-חלד (Personna Super)
פקק בורג צינורות מיקרוצנטריפוגות (2 מ"ל)	VWR	16466-044
צינורות מיקרוצנטריפוגות (0.6 מ"ל)	Axygen סיינטיפיק	MCT-060-C
דבק רקמות	טד פלה בע"מ	10033	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C או 20°C למשך 3 חודשים או יותר לאחסון
מצלמה עם שבב CCD ללא תריס מכני	האמאמאטסו	C4742-95
תוכנת מצלמה	התקנים מולקולריים	MetaMorph גרסה 7.7.0.0
לדמיין אנליזה	אדובי	פוטושופ CS4
משקפי מיקרו כיסוי, מרובע, מס' 1	VWR	48366-067	22 x 22 מ"מ (7/8 x 7/8 אינץ')-כוסות כיסוי עמידות בפני קורוזיה
מגלשות מיקרו חלביות, 1 מ"מ	VWR	48312-003	75 x 25 מ"מ - 1 מ"מ
אמוניום הידרוקסיד	EMD	AX1303-6	מספר CAS: 1336-21-6
אשלגן פרמנגנט	סיגמא	223468	מספר CAS 7722-64-7