צביעה לבנה Calcofluor: שיטה פשוטה להדמיית פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי UV של משקעי תאית בדפנות התא של קטעי גזע צמח דיקוט

תקציר

מקור: Pradhan M. et al. צביעה היסטוכימית של רכיבי דופן התא המשני Arabidopsis thaliana . J. Vis. Exp. (2014)

בסרטון זה, אנו מתארים הליך צביעה כדי לדמיין שקיעת תאית בתוך דפנות התא של Arabidopsis thaliana, צמח דיקוט, באמצעות calcofluor לבן, אשר נקשר במיוחד גלוקנים הקשורים β, מציג פלואורסצנטיות תחת אור UV.

פרוטוקול

1. שיבוץ גזע

1. הכינו תמיסת אגרוז 7% במים (7 גרם אגרוז בדרגת אלקטרופורזה במים מזוקקים של 100 מ"ל). יש להמיס את האגרוז על ידי אוטוקלאבינג למשך 20 דקות או על ידי גלי מיקרו למשך 20 דקות בעוצמה הנמוכה ביותר (למשל, עוצמה של 10% של מיקרוגל של 1,250 וואט).
2. מכינים תבנית ביתית להטמעת הגבעולים באמצעות בקבוקוני פלסטיק.
   1. באמצעות סכין גילוח, חתכו את התחתית החרוטית של צינור מיקרוצנטריפוגה בעל מכסה בורג של 2 מ"ל (חלק A). בעזרת מחט מזרק, נקבו חור במכסה הצינור מעט גדול מקוטר הגבעול שיש להטביע. לאחר מכן, לחתוך 0.5 ס"מ מהתחתית של צינור מיקרוצנטריפוגה 0.6 מ"ל (חלק B).
   2. הוסף את החלק החתוך 0.5 ס"מ של צינור מיקרוצנטריפוגה 0.6 מ"ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל חתוך מראש. אטמו את שני החלקים באמצעות Parafilm (איור 1).
      הערה: תחתית הצינור נחתכת כדי להקל על הסרת הדגימה המשובצת לאחר שהאגרוז התמצק. החור בכובע יסייע להחזיק את הגבעול יציב כאשר הגבעול מוטבע באגרוז. התבנית תשמש להחזיק את האגרוז ולהחזיק את הגבעול ישר בעת ההטבעה. הפרפילם יחזיק את שני החלקים, A ו-B, עד לקיבוע האגרוז ולהטמעת הגבעול.
   3. באמצעות סכין גילוח, חתכו קטע גזע מאזור העניין (למשל אמצע צומת הגבעול הראשון).
      הערה: באופן אידיאלי, יש לחתוך את הגבעול ממש לפני ההטבעה כדי למנוע הרס על ידי התייבשות. לחלופין, ניתן לאחסן את הגבעול באופן זמני בצלחת המכילה נייר סינון רטוב במים. ניתן להניח צלחת זו על קרח עד שהיא מוכנה להטמעה כדי למנוע התייבשות ועיוות של רקמות. אחסון הגבעול לפרקי זמן ארוכים מ-30 דקות ללא לחות גבוהה יגרום לגבעול להתייבש.
3. ממיסים את האגרוז במיקרוגל בעוצמה נמוכה.
   אזהרה: הבקבוק המכיל אגרוז עשוי להיות חם. השתמש בכפפה כדי להרים את הבקבוק. תן agarose מומס לעמוד בטמפרטורת החדר (בין 20 ° C ו 25 ° C) עד שהוא מתקרר כ 50 ° C.
4. לאט פיפטה 5 מ"ל של agarose לתוך תבנית פלסטיק מוכן מראש למלא את בקבוקון.
   הערה: ודאו שאין בועות אוויר בתבניות. בועות אוויר יגרמו לרווחים בתבנית האגרוז ולא יכסו לחלוטין את דגימת הגבעול, מה שיוביל בסופו של דבר לחיתוך לא אחיד של חלקי הדגימה.
   1. תנו לאגרוז להתקרר למשך 30 עד 60 שניות כדי להפוך למוצק למחצה. בדוק עם קיסם קטן, לוודא שהוא יכול לחדור ולעמוד, אבל לא לצוף, באגרוז.
      הערה: אם הגבעול ממוקם כאשר האגרוז עדיין חם הוא יפגע בדגימה על ידי כיווץ הגבעול, והורס את המורפולוגיה של התא.
   2. מניחים את הגבעול בבקבוקון מלא אגרוס זה. ודא כי הגבעול נשאר ישר. מניחים את הכובע המחורר כך שקצה הגבעול מוחזק על ידי הכובע. אין לסובב את מכסה ההברגה. לפעמים יותר מגבעול אחד (מסוג אחד) יכול להיות משובץ בבקבוקון אחד; אך במקרה ספציפי זה, אל תשתמש ב- cap.
      הערה: אם מסובבים את מכסה ההברגה, הגבעול יתעקם.
5. השאירו את הבקבוקון בטמפרטורת החדר או ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10-30 דקות, עד שהוא מתמצק.
6. הסירו את התבנית על ידי החלקתה בעדינות אל מחוץ לצינור. פתח את Parafilm. דחפו את החלק התחתון של חלק B של התבנית בעדינות עם האגודל כדי לשחרר את האגרוז המוצק מחלק A אל מגלשת מיקרוסקופ זכוכית.
7. חותכים את הגבעול המשובץ אגרוז לשלוש חתיכות שוות בערך באורך 1.2 ס"מ. חותכים את החלק של הגבעול שלא היה באגרוז ומשליכים אותו.
   1. אחסנו את חתיכות האגרוז האלה עם הגבעולים המשובצים בצינורות מיקרוצנטריפוגות אטומים של 2 מ"ל בקופסה חשוכה בטמפרטורה של 4°C עד שהם מוכנים לחתך. לחלופין, יש לאחסן את הצינורות בטמפרטורה של 4°C למשך שבוע לכל היותר.
      הערה: אחסון אפשרי, אך הנסיין צריך להיות מודע לכך שהגבעולים המשובצים עדיין חיים, ובהתאם לניסוי, ממצאים עשויים להיות מוצגים.

2. חתך גזע

CAUTION: יש לקרוא בעיון את מדריך הוויברטום ולעקוב אחר כל הוראות הבטיחות.

1. ודא שדיסק הדגימה נקי ויבש לחלוטין (ללא מוצק או נוזל). נקו את דיסק הדגימה עם סכין גילוח כדי להסיר שאריות דבק מניסויים קודמים ושטפו במים. לאחר מכן יבש עם מגבת נייר.
   הערה: פעולה זו תבטיח שהדבק יעבוד היטב וייקשר לדגימת האגרוז. אם שלב זה לא נעשה כראוי, ייתכן שהדגימה לא תיצמד לדיסק ומאוחר יותר תגרום לדגימה ליפול מהדיסק במהלך החיתוך.
   1. השתמשו במגבוני נייר רכים כדי להסיר לחות מגוש האגרוז המכיל את הדגימות.
   2. הניחו טיפה קטנה של דבק טישו על דיסק הדגימה. פזרו את הדבק כדי לכסות את האזור במרכז הצלחת בעזרת קצה בקבוק ההדבקה. מקם במהירות את בלוק האגרוז כך שהדגימות יהיו בניצב או במקביל ללוח עבור חתכים רוחביים או אורכיים, בהתאמה. אפשרו לדבק לקבע את הדגימה לדיסק הדגימה בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של 4°C למשך 10-30 דקות.
      הערה: זהו שלב תלוי זמן.
2. תקן את דיסק הדגימה במקומו על מגש המאגר או השוקת. הבלוק / ים של agarose עם החלקים צריך להיות במקביל סכין גילוח. ממלאים את מגש החיץ במים מזוקקים בטמפרטורת החדר עד שהדגימות שקועות לחלוטין.
3. חותכים סכין גילוח לשניים ואז חותכים את הקצוות עם מספריים קשיחים כך שהלהב נשאר שטוח לחלוטין. חברו מחצית מסכין הגילוח החתוך מראש למחזיק הסכין.
   1. כוונו את הזווית על מחזיק הסכין ל-84°, את המהירות ל-0.90 מ"מ/שנייה (מיקום 8 בוויברטום) ואת התדר ל-50 הרץ (מיקום 5 בוויברטום). חותכים חלקים בעובי 100 מיקרומטר. השתמש במצב רציף.
      הערה: עובי זה נבחר כדי להבטיח שהרקמה תוכל לעמוד בטיפולי החומצה והבסיס השונים המשמשים בחלק מפרוטוקולי הצביעה. הגדר את החלון לחתך ואפשר 15-20 דקות במצב רציף עבור הוויברטום לחתוך גוש אגרוז של כ 1.2 ס"מ.
4. אספו את המקטעים באמצעות פיפטת פלסטיק חד פעמית במהלך החתך במגש החיץ. לחלופין, ניתן להעביר את החלקים ממגש החיץ לתוך זכוכית ולאחר מכן לצלחת פטרי שקופה. העבר כמה חלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל.
   הערה: הדגימות נאספות מצלחת פטרי מכיוון שקל יותר לראות את החלקים על רקע ברור, ומכיוון שניתן להכין את מגש החיץ לדגימה הבאה.
5. ניתן לאחסן את החלקים בצינור של 50 מ"ל או לאסוף ולאחסן בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 עד 2 מ"ל ב -4 ° C למשך 30 עד 60 דקות.
   הערה: אחסון המקטעים לפרקי זמן ארוכים יותר יגרום לאיכות תמונה ירודה.

3. צביעה לבנה Calcofluor

1. יש להמיס 0.02 גרם של חומר הבהרה פלואורסצנטי 28 (calcofluor white M2R) במים מזוקקים של 10 מ"ל להכנת תמיסת מלאי של 0.2%. תמיסה 0.2% ניתן לאחסן במשך שישה חודשים בבקבוק כהה ב 4 ° C. להכין פתרון עבודה של 0.02% על ידי דילול 0.2% תמיסת מלאי 10x עם מים מזוקקים.
2. מעבירים את קטעי הגבעול לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2.0 מ"ל. הוסף לצינור 1 מ"ל של 0.02% calcofluor פתרון לבן. פיפטה עדינה את הפתרון הלבן 0.02% calcofluor למעלה ולמטה.
   הערה: היזהר לא להכניס את המקטעים לקצה פיפטה מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק למקטעים.
   1. דוגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות וחוזרים על הצנרת. דוגרים על הקטע עוד 3 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: אפשר למקטעים להתיישב בתחתית הצינור כדי להקל על הוצאת התמיסה מבלי לפגוע בחלקים.
   2. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשאוב 700 μl של 0.02% calcofluor פתרון לבן ולהוסיף 700 μl של מים מזוקקים; לחכות 5 דקות כדי לשטוף את תמיסת calcofluor לבן. חזור על הכביסה 3-4x. השתמש פיפטה 1 מ"ל עם קצה פיפטה לחתוך באופן כזה את החלקים ניתן pipeted החוצה בקלות ללא נזק.
   3. מקטעי פיפטה עדינים לתוך הקצה ועל מגלשת מיקרוסקופ ומכסים אותם בכיסוי. שימו לב לקטעים תחת אור UV.

תוצאות

איור 1. תבנית ביתית להטמעת הגבעולים. בצד שמאל; החלק העליון של צינור מיקרוצנטריפוגה עם מכסה בורג של 2 מ"ל (חלק A) והחלק התחתון של צינור מיקרוצנטריפוגה של 0.6 מ"ל (חלק B). בצד ימין; הפרפילם מחזיק את שני החלקים; A ו- B כדי ליצור את התבנית הסופית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	EMD	MERC2125	מספר CAS: 9012-36-6
מבהיר פלואורסצנטי 28/ כתם לבן Calcofluor	סיגמא	F3543	4,4'-ביס[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-חומצה דיסולפונית [מספר CAS 4404-43-7]
ויברטומה	לייקה	מיקרוטום להב רוטט של Leica VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
תער	חברת סכיני הגילוח American Safety	פריט # 60-0139-0000	להב קצה כפול מפלדת אל-חלד (Personna Super)
פקק בורג צינורות מיקרוצנטריפוגות (2 מ"ל)	VWR	16466-044
צינורות מיקרוצנטריפוגות (0.6 מ"ל)	Axygen סיינטיפיק	MCT-060-C
מיט	בל-ארט	380000000	SCIENCEWARE מגן יד חם מיט
דבק רקמות	טד פלה בע"מ	10033	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C או 20°C למשך 3 חודשים או יותר לאחסון
מיקרוגל	פנסוניק	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 דבק רקמות מיידי
משקפי מיקרו כיסוי, מרובע, מס' 1	VWR	48366-067	22 x 22 מ"מ (7/8 x 7/8 אינץ')-כוסות כיסוי עמידות בפני קורוזיה ועובות ושטוחות באופן אחיד. עובי מס '1 הוא 0.13 עד 0.17 מ"מ.
מגלשות מיקרו חלביות, 1 מ"מ	VWR	48312-003	75 x 25 מ"מ - 1 מ"מ
פארפילם מ	אריזת אלקאן	BRNDPM998