מאמר שיטה

טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של Anion-Exchange: טכניקת הפרדה לבידוד חלבון מעניין מליזט חיידקי על בסיס מטען נטו

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Fuehner, S., et al. טיהור S100A12 האדם והאוליגומרים המושרים על ידי יונים לגירוי תאי מערכת החיסון J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של חילופי אניונים לטיהור S100A12 חלבון קושר סידן אנושי בהתבסס על מטען פני השטח נטו של החלבון מתרבית Escherichia coli.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טיהור חלבונים

  1. כרומטוגרפיה של חילופי אניון
    1. דיאליזה
      1. הכן חיץ A של כרומטוגרפיה של חילופי אניונים (AIEX) על ידי המסת 20 mM Tris, 1 mM EDTA ו- 1 mM אתילן גליקול-ביס(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-חומצה טטראצטית (EGTA) במים שעברו דה-יוניזציה וכוונן את ה- pH ל- 8.5 עם HCl. לדיאליזה להכין 2 x5 L ולכרומטוגרפיה 2x 1 L של חיץ AIEX A.
        הערה: נפח הדיאליזה צריך להיות בערך פי 100 מנפח הדגימה. כל החוצצים המשמשים לכרומטוגרפיה צריכים להיות מסוננים (0.45 מיקרומטר או פחות) ומנוטרלים גזים (למשל, על ידי אמבטיה קולית או פירוק גזים בוואקום).
      2. חתכו את צינורות הדיאליזה (חיתוך משקל מולקולרי [MWCO]: 3.5 kDa) לאורך מתאים עם מקום נוסף לאוויר כדי להבטיח ציפה מדגמית מעל מוט הערבוב המסתובב.
        הערה: גליצרול משמר את הממברנה ויש להסירו לפני השימוש.
      3. כדי להפחית את צמיגות תמיסת החלבון המנוקה, דלל את התמיסה עם 25 מ"ל של חיץ AIEX A כדי להקל על היישום הבא על עמודת הכרומטוגרפיה. מחברים את הסגירה הראשונה לצינורית, מעמיסים את הדגימה לתוך הממברנה ומחברים את הסגירה השנייה לפחות 1 ס"מ מהקצה העליון של הצינור.
      4. מניחים את מיכל 5 ליטר עם חיץ AIEX A על צלחת ערבוב, מוסיפים חטיף ערבוב ואת הממברנה מלאה בתמיסת חלבון. התאימו את המהירות לסיבוב הדגימה על ידי הימנעות מהפרעה למוט הערבוב המסתובב. יש ליצור דיאליז במשך 12-24 שעות בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן להחליף את מאגר הדיאליזה (AIEX buffer A) בתכשיר טרי מקורר מראש ולהמשיך לפחות 4 שעות נוספות. העבר את תמיסת החלבון המחויג לצינור של 50 מ"ל וסנן דרך יחידת סינון של 0.45 מיקרומטר.
        הערה: אחסון אפשרי.
    2. כרומטוגרפיה
      1. הפעל את מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית (FPLC) עם תחזוקה כללית, חבר את מאגרי העמודות AIEX A ו- AIEX B (AIEX buffer A עם 1 M NaCl) ואת שרף חילופי האניונים המכיל עמודה. עיין בטבלה 1 לקבלת פרמטרים כרומטוגרפיים כלליים.
        הערה: יש לאזן את החוצצים, העמודות וציוד ה-FPLC לאותה טמפרטורה לפני תחילת הריצה (עיין בפרמטרים כרומטוגרפיים בטבלה 1, טבלה 2).
      2. אזנו את העמודה עם מאגר AIEX A, לאחר מכן טענו את הדגימה על העמודה והדפו את החלבונים עם שיפוע ליניארי מ-0% ל-100% חיץ מלח גבוה (AIEX B). עיין בטבלה 2 לקבלת פרוטוקול שיטה מפורט.
      3. אספו 2 שברים מ"ל במהלך ההדחה ונתחו 10 מיקרוליטר מכל שבר על אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד 15% מוכתמת בקומאסי (SDS-PAGE). אגרו את השברים המכילים חלבון S100A12 לדיאליזה.
        הערה: המשקל המולקולרי של S100A12 הוא 10,575 Da.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלה 1: מידע מפורט על הפרמטרים המיושמים של כרומטוגרפיית חילופי אניון.

נפח מיטה (CV)75 מ"ל
צגספיגה ב-280 ננומטר
לחץ מקסימלי3 בר
מאגר עמודות A20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8.5
מאגר עמודות B20 mM Tris-HCl, 1 mM...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
25% HCl  קארל רות'  X897.1
4− 20% ג'ל חלבון Mini-PROTEAN TGX  ביו-רד  4561093
Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution  ביו-רד  1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution  ביו-רד  1610436
}EDTA מלח דיסודיום דיהידרט  קארל רות'  8043.1
EGTA  קארל רות'  3054.3
Q Sepharose Fast Flow  GE בריאות  17-0510-01  שרף לכרומטוגרפיה של חילופי אניונים
נתרן כלורי (NaCl)  קארל רות'  3957.2
נתרן הידרוקסיד  קארל רות'  P031.1
Tris Base  קארל רות'  4855.3
0.45 &מיקרו; מסנן מזרק M  מרק  SLHA033SS
5 L כוס מדידה  קארל רות'  CKN3.1
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים  קורנינג  430829
סגירת צינורות דיאליזה  ספקטרום  132738
צינורות אספן שברים 5 מ"ל  גריינר  115101
ממברנת דיאליזה ספקטרה/פור (3.5 kDa)ספקטרום  132724
יחידת מסנן Steritop  מרק  SCGPT01RE
Ä מטהר KTA UPC 10  GE בריאות  מערכת FPLC
אספן שברים  GE בריאות  Frac-920
Mini Protean Tetra Cell  ביו-רד  1658000EDU
NanoPhotometer  אימפלן  P330
מד pH  ניק  765

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FPLCCross Linked Agarose

מאמרים קשורים