כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית תלוית סידן: טכניקה לטיהור חלבונים קושרי סידן המבוססים על אינטראקציות הידרופוביות

תקציר

מקור: Fuehner, S., et al., טיהור S100A12 האדם והאוליגומרים המושרים על ידי יונים לגירוי תאי מערכת החיסון. J. Vis. Exp. (2019).

בסרטון זה, אנו מדגימים את הטיהור של חלבון קושר סידן מליזט תאי באמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית תלוית סידן. החלבונים קושרי הסידן חושפים אזור הידרופובי בעת קשירה לסידן, מה שמקל על אינטראקציה עם קבוצה הידרופובית על שרף. מאוחר יותר חלבונים אלה מדוללים באמצעות סידן chelator EDTA שהופך את האינטראקציה.

פרוטוקול

1. כרומטוגרפיה הידרופובית-אינטראקציה תלוית סידן (HIC)

1. דיאליזה
   1. Dialyze תמיסת חלבון נגד 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5
2. כרומטוגרפיה
   1. הכן 1 ליטר של חיץ כרומטוגרפיה HIC A על ידי המסת 20 mM Tris, 140 mM NaCl ו- 25 mM CaCl2 במים נטולי יונים, וכוונן את ה- pH ל- 7.5. עבור HIC buffer B, יש להמיס 20 mM Tris, 140 mM NaCl ו- 50 mM EDTA. כוונן את ה- pH ל- 7.0 וסנן ונטרל את החוצצים. הוסף CaCl2 לדגימה לריכוז סופי של 25 mM וסנן דרך 0.45 מיקרומטר. איזון מאגרי HIC ודגימה ל- 4 °C (טמפרטורת עמודה).
   2. הפעל את מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית עם תחזוקה כללית, חבר את מאגרי העמודות HIC A ו- B ואת העמודה. עיין בטבלה 1 לקבלת פרמטרים כרומטוגרפיים נוספים.
   3. אזנו את העמודה, טענו את הדגימה והרחיבו את בלוק 'שטף דגימה לא מאוגדת' עד שאות ה- UV יגיע שוב לרמת קו הבסיס. לאחר מכן התחל elution עם כלטור סידן המכיל חיץ (EDTA). עיין בטבלה 2 לקבלת פרוטוקול שיטה מפורט.
      הערה: ניסויים קודמים הראו כי עודף של סידן נראה מועיל לקשירת S100A12 לשרף הכרומטוגרפיה.
   4. אסוף שברי שיא של 2 מ"ל ונתח 10 μL מכל שבר על 15% SDS-PAGE מוכתם בקומאסי. יש לאגור שברים S100A12 טהורים ולדיאליזה כנגד מי מלח חוצצים של Hepes (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0).
      הערה: מקדם ההכחדה של S100A12 מונומרי הוא 2980 M-1 cm-1.

תוצאות

טבלה 1: מידע מפורט על הפרמטרים המיושמים של כרומטוגרפיית אינטראקציה הידרופובית.

...

חסימה	נפח	מאגר	לשקע
שיווי משקל	כרכים של 1-2 עמודות (CV)	א	פסולת
עומס לדוגמה	לא ישים	א

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כימי
EDTA מלח דיסודיום דיהידראט	קרל רות'	8043.1
פניל ספארוז ביצועים גבוהים	GE שירותי בריאות	17-1082-01	שרף לכרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית
נתרן כלורי (NaCl)	קרל רות'	3957.2
נתרן הידרוקסידי	קרל רות'	P031.1
בסיס טריס	קרל רות'	4855.3
25% HCl	קרל רות'	X897.1
סידןכלוריד דיהידרט	קרל רות'	5239.1
Labware
מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר	מרק	SLHA033SS
14 מ"ל צינורות עגולים	ב.ד.	352059
2 ליטר בקבוק Erlenmyer	קרל רות'	LY98.1
צינורות אספן שברים 5 מ"ל	גריינר	115101
קרום דיאליזה ספקטרה/פור (3.5 kDa)	ספקטרום	132724
יחידת סינון סטריטופ	מרק	SCGPT01RE
ציוד
אספן שברים	GE שירותי בריאות	Frac-920