טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של ניקל: טכניקה לטיהור חלבונים רקומביננטיים מתויגים פוליהיסטידין מליזט תאי חיידקים

תקציר

מקור: Pokhrel, A. et al. A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת הכרומטוגרפיה של זיקה לניקל לטיהור אנזימי פירופוספוקינאז המתויגים בהיסטידין מחיידקי Clostridium difficile.

פרוטוקול

1. טיהור חלבונים על ידי כרומטוגרפיית זיקה לניקל

1. לטהר חלבון באמצעות 1 מ"ל של שרף ניקל-חומצה ניטרילואצטית (Ni-NTA) על עמוד כבידה.
   1. יום לפני השימוש, יש לאזן את העמודה למשך הלילה ב-4°C עם 2 מ"ל של חיץ שיווי משקל (10 mM Tris-HCl pH 7.79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 0.5 mg/mL lysozyme, 5 mM MgCl₂, 10 mM imidazole, 0.25 mM DTT, 5 mM פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF), 10% גליצרול).
   2. למחרת הביאו את העמוד מ-4°C ל-RT לפני טעינת הליזט המובהר, ותנו לו לעמוד על ~2-3 h.
      הערה: הבאת העמוד לשיווי משקל תרמי חיונית למניעת היווצרות בועות אוויר בתוך העמודה.
   3. יש להשהות מחדש את הגלולה במאגר הליזיס (10 mM Tris-HCl pH 7.8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 10% גליצרול, 0.5 מ"ג/מ"ל ליזואנזים, 10 mM imidazole, 0.25 mM DTT ו-5 mM PMSF).
   4. סוניק תאים על קרח במשך 8 x 10 שניות מרווחים, השהיה 30 שניות בין פולסים.
   5. להבהיר את הליזט על ידי צנטריפוגה ב 3,080 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C באמצעות מיקרוצנטריפוגה.
   6. הכינו ליזט עם נפחים שווים של חיץ ליזיס, ולאחר מכן מרחו את הליזט המובהר, שהוכנה מראש, על העמודה, ואספו את הזרימה.
   7. יש למרוח מחדש את זרימת הליזט המובהרת על העמודה ולאסוף את הזרימה המשנית.
   8. שטפו את העמוד עם חיץ כביסה 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 30 mM imidazole, 10% גליצרול). אסוף את flow-through.
      הערה: הכללת 5 mM MgCl₂ במאגרים של שטיפה ואלוציה חשובה לפעילות אנזימטית של החלבון המטוהר.
   9. שטפו את העמוד עם חיץ כביסה 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄ ו-50 mM imidazole).
   10. אסוף את הזרימה.
   11. יש למרוח 2 מ"ל חיץ אלוציה (10 מ"מ Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 10% גליצרול ו-75 מילימטר אימידזול). איסוף זרימה בשני שברים של 1 מ"ל כל אחד.
       הערה: ניתן לאחסן את העמודה לאחר שלב זה במאגר שיווי משקל ב -4 מעלות צלזיוס אם אותו חלבון יטוהר בבדיקת הטיהור הבאה. ניתן להשתמש בעמודה עד 3 פעמים אם היא מאוחסנת כראוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שרף ני-נת"ע	G Biosciences	786-940/941
עמודי כבידה חד פעמיים של פירס, 10 מ"ל	תרמו סיינטיפיק	29924
1 מ"ל מכשיר דיאליזה Spectra/ Por float-A-lyzer G2 (MWCO: 20-kD)	ספקטרום	G235033
מעבד אולטראסוני	סוניקס	VC-750
מיקרוצנטריפוגה עם רוטור D3024/D3024R	Scilogex