$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. מיצוי סך כל השומנים שאינם מקושרים לקוולנטיות ממיקובקטריה (איור 1)
- יש לגרד 0.2 גרם מיקובקטריה ממדיה מוצקה ולהוסיף לצינור זכוכית עם מכסי בורג תוחם פוליטטרה-פלואורואתלן (PTFE). הוסף תמיסה המורכבת מ-5 מ"ל כלורופורם ו-10 מ"ל מתנול (כלורופורם: מתנול, 1:2).
הערה: כאשר משתמשים בממסים אורגניים, יש להשתמש רק בנמען זכוכית. אין להכניס מיכלי פלסטיק. יתר על כן, פקקי בורג אניה PTFE עבור בקבוקים נדרשים.
זהירות: כלורופורם הוא חומר רעיל ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: מתנול הוא חומר רעיל ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
- השאירו את הצינור בערבוב מתמיד למשך הלילה כדי לחלץ שומנים שאינם מקושרים לקוולנטית מפני השטח של התא המיקובקטריאלי.
הערה: אם פלטפורמת ניעור מסלולית אינה זמינה, ניתן להחליף ערבוב קבוע בערבוב ידני תקופתי בתדירות גבוהה ככל האפשר.
- מכסים משפך זכוכית בנייר פילטר, מסננים את הממיסים האורגניים ואוספים אותם בצינור זכוכית.
- השתמש בשטף גז חנקן כדי לאדות את הפאזה הנוזלית בצינור. מלא את הצינור בגז חנקן, כסה ואחסן אותו ב 4 ° C.
הערה: חברו פיפטה מזכוכית פסטר לזרם גז החנקן כדי לאדות באופן ספציפי את הצינור הרצוי. בנוסף, שמור את הצינור בתוך תנור בלוק יבש עבור צינורות ב 37 ° C. כאשר הממס מתאדה, מלא את הצינור בגז חנקן לפני סגירתו.
- הוסף 15 מ"ל של תמיסה של כלורופורם:מתנול (2: 1) לפסולת התא. השאירו את הצינור בערבוב מתמיד למשך הלילה כדי לחלץ שומנים שאינם מקושרים קוולנטית מפני השטח של התא המיקובקטריאלי.
הערה: אם פלטפורמת ניעור מסלולית אינה זמינה, ניתן להחליף ערבוב קבוע בערבוב ידני תקופתי בתדירות גבוהה ככל האפשר.
- תנו לתערובת לנוח במשך שעה. עם פיפטה פסטר, לשחזר את ממיסים אורגניים. כסו משפך זכוכית בנייר פילטר וסננו את הממיסים האורגניים ואספו אותם באותו צינור זכוכית ששימש בעבר בשלב 1.3. השתמש בשטף גז חנקן כדי לאדות את הפאזה הנוזלית בצינור. מלא את הצינור בגז חנקן, סגור אותו ואחסן אותו שוב ב 4 °C.
2. מיצוי חומצה מיקולית על-ידי חומצה מתאנליזה (איור 2A)
- הוסף 2-5 מ"ל של פתרון esterifying לתוך צינור זכוכית הרמטי עם מכסה בורג אניה PTFE. הוסף 0.2 גרם של ביומסה מיקובקטריה לתוך צינור זכוכית.
הערה: פתרון esterifying נוצר על ידי ערבוב 30 מ"ל של מתנול, 15 מ"ל של טולואן, ו 1 מ"ל של חומצה גופרתית. תאי מיקובקטריה יכולים להילקח מתרביות מוצקות או, אפילו מתאים נטולי שומנים לאחר ביצוע מיצוי של סך כל השומנים שאינם מקושרים קוולנטית ממיקובקטריה (התאים הנותרים לאחר סינון בשלב 1.6).
זהירות: טולואן הוא חומר דליק ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: חומצה גופרתית היא חומר מאכל ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
- מערבבים את התוכן על ידי מערבולת. הניחו לתערובת לעמוד בתוך אמבטיה יבשה בטמפרטורה של 80°C למשך הלילה.
- תנו לצינור להתקרר עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר ואז הוסיפו 2 מ"ל של n-הקסאן לצינור. מערבבים את התוכן על ידי מערבולות במשך 30 שניות ומאפשרים לצינור לשקוע עד שמופיעים שני שלבים ברורים.
אזהרה: n-הקסאן הוא חומר דליק, מגרה, מזיק לסביבה ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
- לשחזר את השלב העליון המתאים לשלב n-hexane. העבר אותו לצינור חדש.
- חזור על שלב 2.3. לשחזר את השלב העליון שוב ולהעביר אותו לאותו צינור המשמש בשלב 2.4.
- אידוי תכולת הצינור באמצעות שטף גז חנקן. מלאו את הצינור בגז חנקן, סגרו אותו ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
3. מיצוי חומצה מיקולית על-ידי ספוניפיקציה ומתילציה (איור 2B)
- יש לגרד 0.2 גרם מיקובקטריה ממדיה מוצקה ולהוסיף לצינור זכוכית עם מכסה בורג PTFE.
- הוסף 2 מ"ל של תמיסת מתנול-בנזן (80:20) המכילה 5% אשלגן הידרוקסיד. מערבבים את התוכן על ידי מערבולת. מחממים את התערובת במשך 3 שעות ב 100°C.
זהירות: בנזן הוא חומר דליק, מסרטן ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
- תנו לצינור להתקרר לטמפרטורת החדר. הוסף 20% חומצה גופרתית כדי להחמיץ את הדגימות כדי להשיג pH = 1.
- הוסף 3 מ"ל של אתר דיאתיל. ערבבו בעדינות את התוכן על ידי ערבול.
- תן לשני השלבים להיווצר על ידי התיישבות. לשחזר את שלב אתר diethyl ולהעביר צינור חדש. חזרו על שלב השטיפה בסך הכל שלוש פעמים.
- לשטוף את תמצית אתר diethyl עם 2 מ"ל של מים מזוקקים ולהעביר את החלק העליון המתאים לאתר diethyl צינור חדש. חזרו על שלב השטיפה בסך הכל שלוש פעמים.
- מוסיפים 2 גרם נתרן גופרתי נטול מים מעל תמצית אתר דיאתיל כדי לייבש אותו.
- סנן את המתלים. אידוי התוכן באמצעות שטף גז חנקן.
- כדי לבצע את שלב המתילציה, יש להמיס 3 גרם של N-nitroso-N-methyl urea בתמיסה מקוררת מראש הנוצרת על ידי 45 מ"ל של אתר דיאתיל ו-9 מ"ל של 40% KOH במים מזוקקים.
זהירות: N-nitroso-N-methylurea הוא חומר רעיל, מגרה, מסרטן ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
- מעבירים את הסופרנאטנט (דיאזומתאן) לבקבוק חדש מקורר בקרח המכיל כדורי אשלגן הידרוקסיד (כ-30 גרם).
הערה: אם לא משתמשים בסופרנאטנט באופן מיידי, ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -20°C למשך מקסימום של 1 שעות
זהירות: כדורי אשלגן הידרוקסיד הם חומר מגרה וקורוזיבי. יש להשתמש בחומר זה במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: דיאזומתאן הוא רעיל מאוד ועלול להיות נפיץ. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם זכוכית בטיחות עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
- הוסף 2 מ"ל של תמיסת האתר המכילה דיאזומתאן, המתקבלת בשלב 3.10, לתוך תמצית אתר דיאתיל מיובש המכיל חומצות מיקוליות, המתקבל בשלב 3.8. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- אידוי התרחיף ב-40°C. מלאו את הצינור בגז חנקן, סגרו אותו ואחסנו את השומנים במתילציה ב-4°C.
הערה: אידוי הדיאזומתאן מתמיסת האתר מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, עד שהאתר מאבד את הצבע הצהוב.
4. ניתוח כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC)
- להרוות את תא TLC זכוכית. כדי לעשות זאת, לכסות את אחד הקירות של תא TLC עם פיסת נייר מסנן ולאפשר לו להיות במגע עם השלב הנייד מורכב על ידי תערובת של ממסים. הניחו את יתרת נפח הממס בתחתית תא TLC.
הערה: החלק התחתון של תא TLC חייב להיות מכוסה על ידי לפחות 1 ס"מ של השלב הנייד. בניסויים הנוכחיים נעשה שימוש בשלבים ניידים שונים לפיתוח ה-TLCs. הם כללו 85 מ"ל של n-הקסאן בתוספת 15 מ"ל של אתר דיאתיל; 100 מ"ל של dichloromethane; 90 מ"ל כלורופורם, 10 מ"ל מתנול ו -1 מ"ל מים; 30 מ"ל של כלורופורם, בתוספת 8 מ"ל מתנול, ו 1 מ"ל מים; 60 מ"ל כלורופורם, בתוספת 35 מ"ל מתנול, ו 8 מ"ל מים; 95 מ"ל כלורופורם בתוספת 5 מ"ל מתנול; ו 90 מ"ל של אתר נפט (60-80 ° C) בתוספת 10 מ"ל של אתר דיאתיל.
הערה: ב-TLC הדו-ממדי, השתמש ב-n-hexane:acetone (95:5) בכיוון הראשון שלוש פעמים, והשתמש בפיתוח יחיד עם toluene:acetone (97:3) בכיוון השני כדי לנתח את הרכב החומצה המיקולית. כדי לנתח PIMs, השתמש בכלורופורם:מתנול:מים (60:30:6) בכיוון הראשון פעם אחת, והשתמש בכלורופורם:חומצה אצטית:מתנול:מים (40:25:3:6) בכיוון השני. כדי לנתח PDIM ו- AG, השתמש באתר נפט (60-80 ° C): אתיל אצטט (98: 2) בכיוון הראשון שלוש פעמים, והשתמש בפיתוח יחיד עם אתר נפט (60-80 ° C): אצטון (98: 2) בכיוון השני.
זהירות: אתר דיאתיל הוא חומר רעיל ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: Dichloromethane הוא חומר רעיל ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: אתר נפט הוא חומר דליק פוטנציאלי, מזיק לסביבה ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: חומצה אצטית היא חומר דליק וקורוזיבי פוטנציאלי. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: אתיל אצטט הוא חומר דליק ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: אצטון הוא חומר דליק ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
- סגור את תא TLC כדי להרוות אותו למשך 20 דקות לפחות. בינתיים, להמיס את השומנים הנמצאים בצינור הזכוכית ב 0.2-1 מ"ל של chloroform.
הערה: ניתן לשנות את הנפח המשמש להמסת השומנים בהתאם לריכוז הרצוי או הצפוי של הדגימה.
- החל 10 μL של כל תרחיף באמצעות צינור זכוכית נימי ישירות על צלחת TLC ולתת לדגימה להתייבש במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: דוגמאות יש להחיל בחלק התחתון של הצלחת משאיר 1 ס"מ מכל צד. יש להפריד דגימות זו מזו למשך 0.5 ס"מ לפחות. לאחר יישום הדגימה על הצלחת, צינורות ניתן להתאדות שוב עם גז חנקן ולאחסן ב 4 ° C לשימוש נוסף.
- הכנס את הלוח לתא TLC רווי המכיל את הפאזה הניידת. אפשר לשלב הנייד לרוץ דרך TLC.
הערה: כל תנועה המופעלת על תא TLC משפיעה על ממס הריצה על הצלחת ומשפיעה על ניידות השומנים. במקרה של ביצוע TLC דו מימדי, שני תאי TLC נדרשים להכיל את שתי מערכות האלוציה.
- הסר את הצלחת מתא TLC כאשר הממס מגיע למרחק של 1 ס"מ מהקצה העליון של הצלחת. השאירו את הצלחת תחת שטף למינרי עד שהסיליקה תייבש לחלוטין.
הערה: במקרה של ניתוח הרכב החומצה המיקולית, באמצעות n-hexane ו diethyl-ether (85: 15), חזור על שלבים 4.4 ו 4.5 פעמיים נוספות, עד הפעלת השלב הנייד שלוש פעמים על צלחת TLC.
- חושפים את הצלחת עם הכתם הנדרש; מחממים את הצלחת במידת הצורך.
הערה: בניסוי הנוכחי, 15-20 מ"ל של התמיסות הבאות שימשו לריסוס לוחות TLC: 10% חומצה מוליבדטופוספורית הידרט באתנול עד הצלחת צהוב בהיר, ואחריו חימום הצלחת ב 120 מעלות צלזיוס; 5% אתנול של 20% α-naphthol בחומצה גופרתית ואחריו חימום הצלחת ב 120 ° C; מגיב מוליבדן כחול (1.3% תחמוצת מוליבדן בחומצה גופרתית 4.2 M) עד הופעת פסי פוספט או 1% אנתרון בחומצה גופרתית.
זהירות: חומצה מוליבדטופוספורית הידרט היא חומר דליק וקורוזיבי. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: אתנול הוא חומר דליק ומסוכן פוטנציאלי. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
אזהרה: 1-נפתול הוא חומר דליק, מאכל ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
זהירות: מגיב תרסיס כחול מוליבדן הוא חומר מאכל, רעיל ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה מנוע זרימה למינרית עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל).
