הטיהור Baculovirus מבוסס כרומטוגרפיה של הפרין: טכניקה לבידוד Baculovirus מ- Supernatant של תאי חרקים

תקציר

מקור: Nasimuzzaman, M. et al., ייצור וטיהור של Baculovirus עבור יישום טיפול גנטי. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הטכניקה לבידוד baculovirus מסופרנאטנט של תא חרק באמצעות כרומטוגרפיית זיקה הפרין. הבידוד מתאפשר על ידי הזיקה בין הפרין בטור לגליקופרוטאין מעטפת הבקולווירוס.

פרוטוקול

1. הכנת מערכת הכרומטוגרפיה

1. הכן את מערכת הכרומטוגרפיה על ידי שטיפה רציפה של קווי הדגימה והחיץ כל אחד במים סטריליים, 1 N נתרן הידרוקסיד, מים וחיץ שטיפה (20 mM נתרן פוספט חיץ המכיל 150 mM נתרן כלורי, pH 7.0) בקצב זרימה ליניארי של 50 מ"ל / דקה.
2. הכן עמוד הפרין 50 מיקרומטר (10 × 10 ס"מ, 7.9 מ"ל נפח עמודה (CV)) על ידי הפעלה רציפה של מאגר ניקוי עמודים (5 CV סטרילי 20 mM נתרן פוספט חיץ המכיל 2 M נתרן כלורי, pH 7.0) ו 5 CV חיץ שטיפה בקצב זרימה ליניארי של 7 מ"ל / דקה.

2. טיהור וקטור Baculovirus

1. הגדר את מערכת הכרומטוגרפיה באופן הבא:
   1. השתמש ביציאת הכניסה לטעינת הדגימה לטעינת הסופרנטנט baculovirus.
   2. השתמש ביציאת כניסת המאגר A1 לטעינת מאגר הכביסה. הכינו בקבוק עם לפחות 500 מ"ל של חיץ כביסה והכניסו את קו חיץ הכביסה לתוך הבקבוק.
   3. השתמש ביציאת כניסת החיץ A2 לטעינת מאגר האלוציה (20 mM נתרן פוספט עם 1.5 M נתרן כלורי, pH 8.0). הכינו בקבוק עם לפחות 500 מ"ל של חיץ אלוציה והכניסו את קו החיץ של אלוציה לתוך הבקבוק.
   4. הכנס מספר צינורות חרוטיים של 50 מ"ל לתוך אספן השברים כדי לאסוף את הטור עובר דרך baculovirus supernatant, את מאגר הכביסה, ואת baculovirus מדולל.
2. אזנו את עמודת הפרין עם חמישה נפחי טורים (CVs) של 7.9 מ"ל של חיץ שטיפה (40 מ"ל) בקצב זרימה ליניארי של 7.0 מ"ל/דקה.
3. עומס של 250 מ"ל של סופרנאטנט baculovirus על עמודת הפרין באמצעות משאבת הדגימה (יציאת דגימת כניסה) של מערכת הכרומטוגרפיה בקצב זרימה ליניארי של 2.0 מ"ל/דקה.
4. הפעל 10 CVs (80 מ"ל) של חיץ שטיפה דרך עמוד הפרין בקצב זרימה ליניארי של 2.0 מ"ל/דקה עד שעקומת הספיגה האולטרה סגולה (UV) (280 ננומטר) חוזרת לקו הבסיס והופכת יציבה.
5. יש להקפיד על חלקיקי הבקולו-וירוס מעמודת הפרין בנפח 7.9 מ"ל עם 5 CVs (40 מ"ל) של חיץ אלוציה בקצב זרימה ליניארי של 4.0 מ"ל/דקה. שימו לב לשיא אלוציה חד של חלבון על הכרומטוגרמה כאשר חלקיקי הבאקולו-וירוס מתנתקים מעמודת הפרין.
6. לאחר ההדבקה, יש לדלל מיד את הסופרנאטנט baculovirus המדולל פי 10 באמצעות מאגר נתרן פוספט של 20 mM במים כדי למנוע השבתה של חלקיקי baculovirus מהלם אוסמוטי במהלך הצנטריפוגה שלאחר מכן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יוצא מן הכלל 150	GE שירותי בריאות	28976337	מערכת כרומטוגרפיה
עמוד פורוס הפרין 50 מיקרומטר	תרמופישר סיינטיפיק	4333414	טור הפרין
חיץ כביסה	בתוך הבית	פריט שאינו קטלוגי	חיץ פוספט 20 mmol / l המכיל 150 mmol / l נתרן כלורי
חיץ אלוציה	בתוך הבית	פריט שאינו קטלוגי	חיץ פוספט 20 mmol / l המכיל 1.5 mol/l נתרן כלורי
50 מ"ל צינור חרוטי	תרמופישר סיינטיפיק	14-959-49א	לאוסף של סופרנאטנט Baculovirus
מאגר ניקוי עמודים	בתוך הבית	פריט שאינו קטלוגי	חיץ פוספט 20 mmol / l המכיל 2.0 mol/l נתרן כלורי
מים סטריליים	בתוך הבית	פריט שאינו קטלוגי	לניקוי Akta Avant
נתרן הידרוקסידי	סיגמא-אולדריץ'	1.09137	לניקוי Akta Avant