כרומטוגרפיית חילופי קטיונים: טכניקה לבידוד חלבון רקומביננטי מטרה מליזט תאי חרקים בהתבסס על מטען פני שטח נטו

תקציר

מקור: Agamasu, C. et al. Fully Processing Recombinant KRAS4b: בידוד ואפיון החלבון הפרנזילציה והמתילציה. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של חילופי קטיונים לבידוד חלבון רקומביננטי מחלבון תא החרק ליזט.

פרוטוקול

1. טיהור חלבונים

1. הכינו חוצצים A–H, כפי שניתן לראות בטבלה 1.

פתרון חיץ	סוכן אגירה (כל 20 mM)	pH	NaCl (mM)	Imidazole (mM)	MgCl2	TCEP
א	HEPES	7.3	300	-	5	1
ב	HEPES	7.3	300	35	5	1
ג	HEPES	7.3	300	500	5	1
ד	MES	6.0	200	-	5	1
ה	MES	6.0	-	-	5	1
ו	MES	6.0	100	-	5	1
ז	MES	6.0	1000	-	5	1
ח	HEPES	7.3	300	-	1	1

2. הכינו את חומרי הטיהור (ראו טבלת חומרים): קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA או כלטורים אחרים; עמודת כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת (IMAC); עמודת כרומטוגרפיית חילופי קטיונים (CEX); מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר; 2 M imidazole (pH = 7.5); אולטרה-צנטריפוגה המסוגלת להכיל 100,000 x גרם; צנטריפוגה במהירות גבוהה המסוגלת ל-4,000 x גרם; יחידות סינון צנטריפוגליות (10 KDa NMWL); ספקטרופוטומטר המסוגל לקרוא ב 280 ננומטר; His6-טבק חרוט וירוס (TEV) פרוטאז; ומכשור כרומטוגרפי המסוגל לערבב שני פתרונות חיץ, ליישם פתרונות על עמודות, ליצור אלוציות הדרגתיות מעמודות ולאסוף שברים מעמודות.
3. הסר את תא החרק ליזט מדיאליזה וצנטריפוגה ב 4,000 x גרם למשך 10 דקות כדי להסיר כל משקע. הדגימה הסופית המובהרת בשלב זה עדיין מעורפלת לעתים קרובות, אך ניתן ליישם אותה ללא עיבוד נוסף על עמודת CEX הבאה.
4. הכינו עמודת חילופי קטיונים של 20 מ"ל (ראו טבלת חומרים) על ידי שטיפה עם שלושה קורות חיים של Buffer G, ולאחר מכן עם שלושה קורות חיים של Buffer F.
   הערה: אמנם לא הערכנו בקפידה שרפים אחרים, אך מספר עמיתים מצאו רזולוציה גרועה עם שרפים שאינם שרף SP Sepharose High Performance.
5. לדלל 20 מ"ל של הדגימה החוגגת לריכוז NaCl סופי של 100 mM על ידי הוספת 20 מ"ל של Buffer E ולהחיל את הדגימה המדוללת על עמודת חילופי קטיונים.
6. המשך לטעון את העמודה על ידי הוספת דגימות מדוללות טריות שהוכנו כמתואר לעיל לצינור העומס מכיוון שהדילול הקודם מתקרב לסוף העומס.
   הערה: דילול הדגימה כולה בבת אחת ל-100 מילימטר NaCl הביא לאובדן משמעותי של חלבון המטרה עקב משקעים.
7. שטף את העמודה לקו הבסיס של Abs280 באמצעות Buffer F. זה בדרך כלל דורש 3 קורות חיים. החלבון מדולל מהעמודה במהלך שיפוע של 400 מ"ל (20 CV) ממאגר F ל-65% Buffer G, שנאסף בשברים של 6 מ"ל (איור 1B).
8. המשך לשטוף את העמודה לקבלת 1.5 קורות חיים נוספים (65% חיץ G) לאחר השלמת מעבר הצבע.

תוצאות

איור 1: ג'לים SDS-PAGE של תהליך הטיהור. (A) לכידת IMAC מליזט. FNTA / B הם הפסים הכהים הנודדים ב~ 48 kDa וה- His6-MBP-tev-KRAS4b הוא הפס הכהה הנודד ב~ 67 kDa. M = סולם משקל מולקולרי חלבוני; T = סך החלבון; L = עומס ליזט / עמודה מובהר; F = זרימת עמודות. שברים מדוללים עם שיפוע ריכוז אימידזול הולך וגדל. (B) שברי CEX המסומנים 1–5 מתאימים לשברי השיא מפסגות האלוטיון. (C) עיכול...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.8 מ"ל צינורות נעילה בטוחה, טבעיים	אפנדורף	22363204
11 מ"מ Cl SS משולב להוסיף בקבוקוני Autosampler	תרמו סיינטיפיק	30211SS-1232
5427R צנטריפוגה	אפנדור
אצטוניטריל, HPLC כיתה	פישר כימיקלים	A998-1 1L
עמודת כרומטוגרפיה של Cation Exchange (CEX)	GE Healthcare מדעי החיים	29018183	HiPrep SP Sepharose ביצועים גבוהים
ספקטרומטר מסות Exactive Plus EMR	תרמו סיינטיפיק
בקבוקוני גילסון צינורות 7x14 מ"מ	GE שירותי בריאות	BR-1002-12
צנטריפוגה מהירה/ספסל	תרמו פישר סיינטיפיק	05-112-114D	מסוגל עד 4,000 xg
פרוטאז His6-Tobacco Etch Virus (TEV)	אדג'ין	92414	מטוהר לפי Raran-Kurussi et al. (2017) הסרת תגי זיקה עם TEV Protease. בתוך: Burgess Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. שיטות בביולוגיה מולקולרית, כרך 1586. Humana Press , ניו יורק, ניו יורק
קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA או כלטורים אחרים	מיליפור סיגמא	P8849
אמוניום אצטט	סיגמא-אולדריץ'	09689-250 גרם
גז ארגון	איירגז	ארופ
חומצה פורמית	סיגמא-אולדריץ'	F0507-500MI	השתמש בדרגת מגיב או טוב יותר
מערכת הכרומטוגרפיה של NGC	BioRad	78880002	מערכת הכרומטוגרפיה NGC QuestTM 100
סט מכבש שומנים עם מחזיק	שומנים אוונטי פולאר	610023
חנקן נוזלי	איירגז	ני-דיואר
יחידות סינון צנטריפוגליות Ultra-15, NMWL 10,000	מיליפור סיגמא	UFC901008	קרום PES
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 מ"ל מסנני צנטריפוגות	אמיקון	UFC501024
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	אופטימה - L80K	מסוגל 100,000 XG
בחורים	סיגמא	C3023