מקור: Agamasu, C. et al. Fully Processing Recombinant KRAS4b: בידוד ואפיון החלבון הפרנזילציה והמתילציה. J. Vis. Exp. (2020)
סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של חילופי קטיונים לבידוד חלבון רקומביננטי מחלבון תא החרק ליזט.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כרומטוגרפיית חילופי קטיונים: טכניקה לבידוד חלבון רקומביננטי מטרה מליזט תאי חרקים בהתבסס על מטען פני שטח נטו
2.4K צפיות
⸱
8 ביולי 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
1. טיהור חלבונים
- הכינו חוצצים A–H, כפי שניתן לראות בטבלה 1.
| פתרון חיץ | סוכן אגירה (כל 20 mM) | pH | NaCl (mM) | Imidazole (mM) | MgCl2 | TCEP |
| א | HEPES | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
| ב | HEPES | 7.3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| ג | HEPES | 7.3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| ד | MES | 6.0 | 200 | - | 5 | 1 |
| ה | MES | 6.0 | - | - | 5 | 1 |
| ו | MES | 6.0 | 100 | - | 5 | 1 |
| ז | MES | 6.0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| ח | HEPES | 7.3 | 300 | - | 1 | 1 |
- הכינו את חומרי הטיהור (ראו טבלת חומרים): קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA או כלטורים אחרים; עמודת כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת (IMAC); עמודת כרומטוגרפיית חילופי קטיונים (CEX); מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר; 2 M imidazole (pH = 7.5); אולטרה-צנטריפוגה המסוגלת להכיל 100,000 x גרם; צנטריפוגה במהירות גבוהה המסוגלת ל-4,000 x גרם; יחידות סינון צנטריפוגליות (10 KDa NMWL); ספקטרופוטומטר המסוגל לקרוא ב 280 ננומטר; His6-טבק חרוט וירוס (TEV) פרוטאז; ומכשור כרומטוגרפי המסוגל לערבב שני פתרונות חיץ, ליישם פתרונות על עמודות, ליצור אלוציות הדרגתיות מעמודות ולאסוף שברים מעמודות.
- הסר את תא החרק ליזט מדיאליזה וצנטריפוגה ב 4,000 x גרם למשך 10 דקות כדי להסיר כל משקע. הדגימה הסופית המובהרת בשלב זה עדיין מעורפלת לעתים קרובות, אך ניתן ליישם אותה ללא עיבוד נוסף על עמודת CEX הבאה.
- הכינו עמודת חילופי קטיונים של 20 מ"ל (ראו טבלת חומרים) על ידי שטיפה עם שלושה קורות חיים של Buffer G, ולאחר מכן עם שלושה קורות חיים של Buffer F.
הערה: אמנם לא הערכנו בקפידה שרפים אחרים, אך מספר עמיתים מצאו רזולוציה גרועה עם שרפים שאינם שרף SP Sepharose High Performance. - לדלל 20 מ"ל של הדגימה החוגגת לריכוז NaCl סופי של 100 mM על ידי הוספת 20 מ"ל של Buffer E ולהחיל את הדגימה המדוללת על עמודת חילופי קטיונים.
- המשך לטעון את העמודה על ידי הוספת דגימות מדוללות טריות שהוכנו כמתואר לעיל לצינור העומס מכיוון שהדילול הקודם מתקרב לסוף העומס.
הערה: דילול הדגימה כולה בבת אחת ל-100 מילימטר NaCl הביא לאובדן משמעותי של חלבון המטרה עקב משקעים. - שטף את העמודה לקו הבסיס של Abs280 באמצעות Buffer F. זה בדרך כלל דורש 3 קורות חיים. החלבון מדולל מהעמודה במהלך שיפוע של 400 מ"ל (20 CV) ממאגר F ל-65% Buffer G, שנאסף בשברים של 6 מ"ל (איור 1B).
- המשך לשטוף את העמודה לקבלת 1.5 קורות חיים נוספים (65% חיץ G) לאחר השלמת מעבר הצבע.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1: ג'לים SDS-PAGE של תהליך הטיהור. (A) לכידת IMAC מליזט. FNTA / B הם הפסים הכהים הנודדים ב~ 48 kDa וה- His6-MBP-tev-KRAS4b הוא הפס הכהה הנודד ב~ 67 kDa. M = סולם משקל מולקולרי חלבוני; T = סך החלבון; L = עומס ליזט / עמודה מובהר; F = זרימת עמודות. שברים מדוללים עם שיפוע ריכוז אימידזול הולך וגדל. (B) שברי CEX המסומנים 1–5 מתאימים לשברי השיא מפסגות האלוטיון. (C) עיכול...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.8 מ"ל צינורות נעילה בטוחה, טבעיים | אפנדורף | 22363204 | |
| 11 מ"מ Cl SS משולב להוסיף בקבוקוני Autosampler | תרמו סיינטיפיק | 30211SS-1232 | |
| 5427R צנטריפוגה | אפנדור | ||
| אצטוניטריל, HPLC כיתה | פישר כימיקלים | A998-1 1L | |
| עמודת כרומטוגרפיה של Cation Exchange (CEX) | GE Healthcare מדעי החיים | 29018183 | HiPrep SP Sepharose ביצועים גבוהים |
| ספקטרומטר מסות Exactive Plus EMR | תרמו סיינטיפיק | ||
| בקבוקוני גילסון צינורות 7x14 מ"מ | GE שירותי בריאות | BR-1002-12 | |
| צנטריפוגה מהירה/ספסל | תרמו פישר סיינטיפיק | 05-112-114D | מסוגל עד 4,000 xg |
| פרוטאז His6-Tobacco Etch Virus (TEV) | אדג'ין | 92414 | מטוהר לפי Raran-Kurussi et al. (2017) הסרת תגי זיקה עם TEV Protease. בתוך: Burgess Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. שיטות בביולוגיה מולקולרית, כרך 1586. Humana Press , ניו יורק, ניו יורק |
| קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA או כלטורים אחרים | מיליפור סיגמא | P8849 | |
| אמוניום אצטט | סיגמא-אולדריץ' | 09689-250 גרם | |
| גז ארגון | איירגז | ארופ | |
| חומצה פורמית | סיגמא-אולדריץ' | F0507-500MI | השתמש בדרגת מגיב או טוב יותר |
| מערכת הכרומטוגרפיה של NGC | BioRad | 78880002 | מערכת הכרומטוגרפיה NGC QuestTM 100 |
| סט מכבש שומנים עם מחזיק | שומנים אוונטי פולאר | 610023 | |
| חנקן נוזלי | איירגז | ני-דיואר | |
| יחידות סינון צנטריפוגליות Ultra-15, NMWL 10,000 | מיליפור סיגמא | UFC901008 | קרום PES |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 מ"ל מסנני צנטריפוגות | אמיקון | UFC501024 | |
| אולטרה-צנטריפוגה | בקמן קולטר | אופטימה - L80K | מסוגל 100,000 XG |
| בחורים | סיגמא | C3023 |
