אי הכללת גודל הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה של שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות: טכניקה להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של בועיות קרום חיצוני של חיידקים גראם-שליליים בהתבסס על גודלן

תקציר

מקור: Collins, S. M., et al., גודל הדרה כרומטוגרפיה לנתח הטרוגניות של שלפוחית הקרום החיצוני של החיידקים. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה – כרומטוגרפיית אי הכללת גודל – להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של שלפוחיות קרום חיצוני או OMV שמקורו בחיידקים. שלפוחיות אלה הן מבנים כדוריים בגודל ננומטרי ומופרדות לתת-אוכלוסיות גדולות וקטנות בהתבסס על גודלן באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

פרוטוקול

1. הכנת מאגרים

1. להכנת מאגר השטיפה של ELISA, יש להוסיף 3.94 גרם Tris-base, 8.77 גרם NaCl ו-1 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) ל-1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה (DI). הוסף 500 μL פוליסורבט-20. כוונן את ה- pH ל- 7.2 באמצעות HCl או NaOH.
2. כדי להכין את מאגר החסימה, הוסף 3.94 גרם בסיס טריס, 8.77 גרם NaCl ו- 10 גרם BSA. הוסף 500 μL פוליסורבט-20 ל 1 ליטר מים DI. כוונן את ה- pH ל- 7.2 באמצעות HCl או NaOH.
3. כדי להכין את מאגר האלוציה (PBS), יש להוסיף 8.01 גרם NaCl, 2.7 גרם KCl, 1.42 גרם Na₂HPO₄ ו-0.24 גרם KH₂PO₄ עד 1 L DI מים. כוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות HCl או NaOH.
   הערה: ניתן לייצר תמיסה 10x של חיץ זה ולדלל במי DI לפי הצורך.

2. הכנת מדגם OMV

1. לגדל A. actinomycetemcomitans תאים לשלב מעריכי מאוחר (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 0.7). גלול את התאים על ידי צנטריפוגה פעמיים ב 10,000 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. סננו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר.
2. רכז את הסופרנאטנט נטול החיידקים באמצעות מסנני חיתוך משקל מולקולרי של 50 kDa. אולטרה-צנטריפוגה את התמיסה המרוכזת ב-105,000 x גרם ב-4°C למשך 30 דקות.
3. השהה שוב את הגלולה ב-PBS ובאולטרה-צנטריפוגה (105,000 x גרם ב-4°C למשך 30 דקות). להשעות את הגלולה ב 2 מ"ל של PBS.

3. אריזת עמודת S-1000

1. מערבבים את בקבוק הציר של מדיום סינון הג'ל עם מוט ערבוב זכוכית ויוצקים לבקבוק זכוכית את הנפח הדרוש למילוי העמוד, בתוספת כ-50% עודף (כ-135 מ"ל). תן חרוזים אלה לשבת עד שהם התיישבו, ולאחר מכן decant את הנוזל העודף. השהה מחדש את החרוזים במאגר אלוציה, כך שהפתרון הסופי יהיה כ 70% (לפי נפח) ג'ל, 30% חיץ. Degas את הפתרון תחת ואקום.
2. הרכיבו את עמוד הזכוכית במאונך באמצעות מעמד טבעתי ומלאו בחיץ אלוציה כדי להרטיב את דפנות העמוד. מסננים את החיץ עד שנותר רק כ-1 ס"מ של חיץ בעמודה.
3. מבלי ליצור בועות, בזהירות פיפטה חרוזים לתוך העמודה, מילוי הטור למעלה. המשך לנקז חיץ עודף לאורך תהליך זה. הקפד לא לתת לחרוזים לשקוע לחלוטין לפני הוספת חרוזים נוספים לראש העמודה. יש לארוז את העמוד לגובה של כ-2 ס"מ מתחת לתחתית מאגר העמודים.

4. טעינת הדגימה ואיסוף שברים

1. נטרל את חיץ האלוציה תחת ואקום. שטפו את העמודה בשני נפחי טורים (180 מ"ל) של מאגר אלוציה.
2. אפשר למאגר הנותר להיכנס במלואו לעמודה. לאחר שהחיץ הגיע לחלק העליון של שכבת הג'ל, יש להניף בזהירות דגימה של 2 מ"ל המכילה OMV (בריכוז שומנים של כ 100 - 200 nmol / L) על פני השטח של החרוזים, תוך זהירות שלא להפריע לאף אחד מהחרוזים בראש העמודה. אפשר את הדגימה להיכנס באופן מלא לג'ל, כלומר, כאשר לא נשאר נוזל מעל שכבת הג'ל.
3. בזהירות ובאיטיות מוסיפים חיץ אלוציה על גבי עמוד הג'ל. אין להפריע לשכבה העליונה של הג'ל, מכיוון שהדבר יגרום לדילול דגימה.
4. מניחים צינור יחיד של 50 מ"ל מתחת לעמודה ופותחים את העמודה. לאסוף את הראשון 20 מ"ל של eluent. הוסף מאגר אלוציה נוסף לראש העמודה, בזהירות, לפי הצורך כדי להבטיח שהעמודה לעולם לא תהיה יבשה.
5. מניחים סדרה של צינורות 1.5 מ"ל מתחת לעמודה. התחל את העמודה ואסוף סדרה של דגימות 1-מ"ל בכל צינור. בעת איסוף הדגימות, המשך להוסיף מאגר אלוציה לראש העמודה, לפי הצורך. חזור על הפעולה עד שנאספו 96 שברים. עצור את העמודה.
   הערה: הדגימות צריכות להיות מאוחסנות ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך או 4 ° C לאחסון לטווח קצר עד ניתוח נוסף.
6. כדי לנקות את העמודה, הפעל אמצעי אחסון עמודה אחד (90 מ"ל) של 0.1 M NaOH לאורך העמודה. הפעל שני כרכי עמודות (180 מ"ל) של מאגר אלוציה דרך העמודה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Amicon 50 kDa מסננים	מיליפור סיגמא	UFC905024
FM 4-64	תרמו סיינטיפיק	T13320	1.5 x 50 ס"מ
עמוד Econo מזכוכית	BioRad	7371552
אשלגן כלורי (KCl)	אמרסקו(VWR)	0395-500 גרם
אשלגן פוספט מונובייסיק נטול מים (KH2PO4)	אמרסקו(VWR)	0781-500 גרם
Sephacryl S-1000 Superfine	GE שירותי בריאות	17-0476-01
נתרן כלורי (NaCl)	פישר כימיקלים	S271-3
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים (Na2HPO4)	אמרסקו(VWR)	0404-500 גרם
בסיס טריס	VWR	0497-1 ק"ג