1. לייצר ולאפיין את הנוגדן
- לבטא את הנוגדן
- הפשירו בקבוקון של תאי השעיה HEK בבקבוק של 250 מ"ל המכיל 50 מ"ל של מדיום ביטוי בתוספת 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 250 ננוגרם / מ"ל אמפוטריצין B. שמור על התאים ב 37 ° C עם 8% CO2 באינקובטורים לחים מצוידים שייקר ב 125 סל"ד. פצל תאים ל- 0.3-0.5 x 106 תאים/מ"ל (כל 2-3 ימים) לפחות פעמיים לפני ההדבקה.
- כאשר מגיעים לצפיפות של 2.5 x 106 תאים/מ"ל (2-3 ימים לאחר הפיצול), הכינו תמיסה חדשה של 100 mM CypK. למטרה זו, לשקול 64 מ"ג של CypK, להוסיף 2.5 מ"ל של 0.1 הידרוקסיד נתרן, מערבולת, להסתובב למטה כדי לשחזר את כל החלקיקים unsolveted ו sonicate.
- הוסף 2.5 מ"ל של CypK (100 mM ב 0.1 M NaOH) ל 42.5 מ"ל של מדיום ביטוי בתוספת אנטיביוטיקה. יש לערבב היטב, להוסיף 250 μL של 0.1 M HCl, ולעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- לדלל 50 מיקרוגרם של HC ו LC pKym1 פלסמידים ל 2.5 מ"ל עם מדיום סרום מופחת. בצינור נפרד, לדלל 135 μL של מגיב transfection ל 2.5 מ"ל עם בינוני בסרום מופחת.
- חמש דקות לאחר הכנת התמיסות, מערבבים את הפלסמידים ואת תמיסת מגיב הטרנספקציה ודגרים במשך 20 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים בין ה- DNA לבין מגיב הטרנספקציה.
- בינתיים, צנטריפוגה 125 מיליון תאים בצפיפות היעד למשך 5 דקות ב 500 x גרם, להשהות מחדש עם מדיום הביטוי המכיל CypK ולהוסיף את תערובת מגיב DNA-transfection. ניתן לרכוש או לסנתז CypK כפי שדווח בעבר.
- לאחר דגירה של תאים במשך 20 שעות, הוסף 250 μL של משפרי מגיב transfection הכלולים בערכה.
- קצירת נוגדנים מהסופרנאטנט 6-7 ימים לאחר הוספת CypK (אין צורך בשינוי בתווך במהלך הביטוי).
*לחלופין, כדי להשיג תפוקות גבוהות ועקביות יותר, ניתן ליצור קו תאים יציב כמתואר ב- Oller-Salvia et al. 2018. במקרה זה, trastuzumab(CypK)2 מבוטא פשוט על ידי תוספת של CypK 5 mM במדיום הביטוי.
- לטהר את הנוגדן
- צנטריפוגה את התאים במשך 15 דקות ב 3000 x גרם.
- סנן את הסופרנאטנט עם מסנן 0.45 או 0.22 מיקרומטר. אם המסנן מסתיר, החלף אותו במסנן חדש והמשך בסינון. אם זה קורה לאחר מיליליטר בודד, צנטריפוגו את הסופרנאטנט למשך 15 דקות נוספות במהירות של 7000 x גרם.
- הוסף חלבון A שרף (2 מ"ל / 100 מ"ל של סופרנטנט) בטור כרומטוגרפיה פוליפרופילן ריק ואזן את השרף עם לפחות 5 נפחים של חיץ שטיפת חרוזים (0.1 M נתרן פוספט, 150 mM NaCl).
- פצלו את הסופרנאטנט לשתי שפופרות חרוטיות של 50 מ"ל והוסיפו חיץ שטיפת חרוזים פי 5 (0.5 מ' נתרן פוספט, 150 מ"מ NaCl) ואחריו את החלבון A שרף מאוזן מראש. הניחו את הצינורית החרוטית על רולר למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר כדי למשוך מטה את הנוגדן בסופרנטנט.
- לחילופין: מוסיפים את הסופרנאטנט על העמוד בנפח כפול לפחות מהשרף המומלץ ומאפשרים לו לזרום דרכו. יש לוודא שלא נשארה כמות משמעותית של נוגדנים בסופרנאטנט על ידי SDS-PAGE. אם יש, יש להפיל שוב את הסופרנאטנט דרך השרף.
- מעבירים חלבון A שרף עם הסופרנאטנט לעמוד ומאפשרים לנוזל לזרום דרכו.
- מוסיפים 25 מ"ל של חיץ כביסה (או לפחות 10 נפחי שרף) ומאפשרים לזרום דרכו.
- להצדיע את הנוגדן עם 4 מ"ל של 0.1 M נתרן ציטראט, pH 3, על 1 מ"ל של 1 M פוספט חיציץ, 150 mM NaCl.
- לדלל את הנוגדן עם 10 מ"ל של PBS, להתרכז ל 0.5-1 מ"ל על ידי סינון צנטריפוגלי, ולהחליף חיץ שלוש פעמים עם PBS.
- לטהר את הדגימות על ידי FPLC באמצעות עמודת butyl HIC עם זרימה של 0.5 מ"ל / דקה ושיפוע 0-100% ב 30 דקות של חיץ מלח נמוך (50 mM נתרן פוספט pH 7.0, 20% isopropanol) במאגר מלח גבוה (1.5 M (NH4)2SO4, 50 mM נתרן פוספט pH 7.0, 5% isopropanol). אסוף את כל השברים ועקוב אחר האלוציה ב 280 ננומטר. כמויות קטנות (< 1 מ"ג) ניתן לטהר עם HPLC-HIC בתנאים המתוארים בסעיף 2.4 כדי למקסם את התשואה והטוהר.
- אסוף את השברים המכילים נוגדן, לדלל אותם לפחות 4 מ"ל עם PBS, לרכז אותם על ידי סינון צנטריפוגלי ולהחליף חיץ שלוש פעמים עם PBS.
- כימות הנוגדן
- קבל ריכוז משוער על ידי מדידת ספיגה ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
- אם נדרשת מדידה מדויקת, השתמש בערכת ELISA כדי למדוד IgG אנושי. לקבלת הערכה גסה, השתמש ב- SDS-PAGE עם כתם מבוסס Coomassie, באופן הבא:
- הכינו תקנים על ידי דילול פי שישה פי שניים מהתקן trastuzumab שכומת על ידי ELISA ב-1 מ"ג/מ"ל.
- מרתיחים את התקנים ואת הדגימות בכ-0.25 מ"ג/מ"ל בהפחתת חיץ ההעמסה.
- הפעל אותם ב- 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE באמצעות חיץ MES-SDS וכתם עם צבע מבוסס Coomassie. לבסוף, מדוד את צפיפות הצבע של הרצועה המתאימה לשרשרת הקלה או הכבדה באמצעות ImageJ ובצע אינטרפולציה של האות מהדגימות בעקומה הסטנדרטית.
- יש לאחסן את הנוגדן בטמפרטורה של 4°C.
2. הצמדת הנוגדן ואפיון ADC
- הצמידו את הנוגדן למולקולה נושאת הטטרזין
- לדלל 10 שווה ערך מולארי של tetrazine-vcMMAE (4 μL, 3.4 mM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)) עם 20 μL של acetonitrile ו 76 μL של PBS בצינור חרוטי קטן (למשל, צינור PCR).
- הוסף 1 שווה ערך מולארי של trastuzumab(CypK)2 (100 μL, 2 מ"ג / מ"ל PBS), לערבב היטב, ולאפשר להגיב במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר (25 ° C) כדי ליצור trastuzumab (MMAE)2.
הערה: מולקולות אחרות כגון tetrazine-5-TAMRA יכולות להיות מקושרות לנוגדן במקום tetrazine-vcMMAE באמצעות פרוטוקול זה.
- לטהר את ADC
- איזון מראש של עמודת ספין אי-הכללת גודל עם PBS בהתאם להוראות היצרן.
- הוסף את כל נפח התגובה על עמוד הסחרור והצנטריפוגה ב 1500 x גרם למשך דקה אחת.
- כימות ADC וניתוח הצמידות על ידי SDS-PAGE
- כמת את ADC כמתואר ב- 1.3.2. על-ידי מדידת צפיפות הצבע של שרשרת האור ב- SDS-PAGE באמצעות נוגדן ללא שינוי עבור העקומה הסטנדרטית.
- השרשרת הכבדה הייתה צריכה להשתנות מעט ולהראות עלייה במשקל המולקולרי עם הצמידה.
הערה: אם הנוגדן שונה עם פלואורופור כגון trastuzumab(TAMRA)2, רק הרצועה המתאימה לשרשרת הכבדה צריכה להראות פלואורסצנטיות בג'ל לפני הצביעה.
- ניתוח הצמידות על ידי HPLC-HIC
- אזן את עמודת HPLC-HIC עם 100% חיץ A (1.5 M (NH4)2SO4, 50 mM נתרן פוספט pH 7.0, 5% איזופרופנול) למשך 5 דקות.
- יש לערבב 15 μL (67 pmol) של תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל של trastuzumab(CypK)2 עם 15 μL של 2x buffer A בבקבוקון. לאחר מכן תכנת הזרקה של 10 μL ב- HPLC.
- יש להאיר בזרימה איזוקרטית של 1 מ"ל/דקה עם 100% חיץ A למשך דקה אחת ואחריה שיפוע של 15 דקות מ-100% עד 0% מחיץ A ב-B (50 מילימטר נתרן פוספט pH 7.0, 20% איזופרופנול). נטר את elution ב 280 ננומטר.
- חשב את ה- DAR על ידי שילוב הפסגה המתאימה לכל מין ושימוש באזורים המתקבלים במשוואה הבאה:
DAR = (1x trastuzumab(MMAE) + 2x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
זמן השמירה הצפוי עבור trastuzumab(CypK)2 הוא 7.5-8.0 דקות, עבור trastuzumab (CypK, MMAE) הוא 9.1-9.6 דקות, ועבור trastuzumab(MMAE)2 הוא 10.5-11.0 דקות.