אינטראקציה הידרופובית תלוית בוטיל כרומטוגרפיה נוזלית: טכניקה לאפיון הצמדות נוגדנים-תרופות בהתבסס על אינטראקציות הידרופוביות

תקציר

מקור: Oller-Salvia, B. קידוד גנטי של חומצת אמינו לא קנונית ליצירת נוגדנים-תרופות מצומדות באמצעות תגובה ביו-אורתוגונלית מהירה. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את האינטראקציה ההידרופובית המבוססת על כרומטוגרפיה נוזלית של צימוד נוגדנים-תרופות. באמצעות עמודת כרומטוגרפיה מבוססת ליגנד בוטיל (butyl ligand), הצמידות בין נוגדנים לתרופות מאופיינות באמצעות אינטראקציות הידרופוביות עם הליגנד.

פרוטוקול

1. לייצר ולאפיין את הנוגדן

1. לבטא את הנוגדן
   1. הפשירו בקבוקון של תאי השעיה HEK בבקבוק של 250 מ"ל המכיל 50 מ"ל של מדיום ביטוי בתוספת 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 250 ננוגרם / מ"ל אמפוטריצין B. שמור על התאים ב 37 ° C עם 8% CO₂ באינקובטורים לחים מצוידים שייקר ב 125 סל"ד. פצל תאים ל- 0.3-0.5 x 10⁶ תאים/מ"ל (כל 2-3 ימים) לפחות פעמיים לפני ההדבקה.
   2. כאשר מגיעים לצפיפות של 2.5 x 10⁶ תאים/מ"ל (2-3 ימים לאחר הפיצול), הכינו תמיסה חדשה של 100 mM CypK. למטרה זו, לשקול 64 מ"ג של CypK, להוסיף 2.5 מ"ל של 0.1 הידרוקסיד נתרן, מערבולת, להסתובב למטה כדי לשחזר את כל החלקיקים unsolveted ו sonicate....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Expi293F	תרמופישר סיינטיפיק	A14527	תאי השעיה HEK
Expi293 Expression Medium	תרמופישר סיינטיפיק	A1435101	אמצעי ביטוי
אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי	תרמופישר סיינטיפיק	15240062	פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B
בקבוק פוליקרבונט Erlenmeyer בנפח 125 מ"ל עם מכסה אוורור	קורנינג	431143	נערו צלוחיות
חממת Brunswick S41i	אפנדורף	S41I230011	אינקובטור CO2 עם שייקר
נתרן הידרוקסידי 4 mol/l (4 N) בתמיסה מימית	VWR	191373מ'
ציקלופרופן ליזין	Sichem	SC-8017	במחקר זה הוא סונתז כפי שתואר על ידי Elliot et al. 2014
Steriflip-GP, 0.22 מיקרומטר, פוליאתרסולפון, גמא מוקרן	מרק מיליפור	SCGP00525
Opti-MEM, סרום מופחת בינוני	תרמופישר סיינטיפיק	31985070	מדיום סרום מופחת
ערכת טרנספקציה ExpiFectamine 293	תרמופישר סיינטיפיק	A14525	מגיב טרנספקציה
5810 R צנטריפוגה	אפנדורף	5811000460
יחידת מסנן מזרק Millex-GP, 0.22 מיקרומטר, פוליאתרסולפון, 33 מ"מ, מעוקר גמא	מרק מיליפור	SLGP033RS
חלבון A שרף	סינו ביולוגי	10600-P07E-RN-25
עמודות כרומטוגרפיה פולי-פרפ, Pkg של 50	ביו-ראד	7311550	עמודת כרומטוגרפיית פוליפרופילן
משפך Econo-Column	ביו-ראד	7310003
נתרן ציטראט	פלוקה	71635
ÄKTA explorer FPLC	GE שירותי בריאות
ערכת בחירת HiTrap HIC	GE שירותי בריאות	28-4110-07	כולל HiTrap 1 מ"ל בוטיל HP
אמוניום סולפט	VWR	2133.296
איזופרופנול	הוניוול	34863-2.5 ליטר
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	D8418-50ML
טטרזין-vcMMAE	ChemPartner	-	תחפושת מסונתזת
טטרזין-5-טמרה	ג'נה ביוסיינס	CLK-017-05
NuPAGE 4-12% Bis-Tris ג'ל 1.0 מ"מ x 10 באר	ThermoFisherScientific	NP0321BOX
Xcell SureLock Mini-Cell	ThermoFisherScientific	EI0001
UltiMate 3000 HPLC	ThermoFisherScientific
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 מ"מ, 5 מיקרומטר	ThermoFisherScientific	88553
NanoAcquity	ווטרס
סרום אנושי	סיגמא-אולדריץ'	H4522-20 מ"ל
אינקובטור CO2	פנסוניק
מונומתיל אוריסטטין E	קיימן כימיקל	16267
ננודרופ 2000	ThermoFisherScientific		ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח
IntantBlue	אקספדאון	ISB1L	כתם על בסיס קומאסי
צינור 50 מ"ל, 114x28 מ"מ, PP	זארשטדט	62.547.254	צינור חרוטי
יחידות מסנן צנטריפוגלי Amicon Ultra-15 50,000 NMWL	מרק	UFC905024	רכז סינון צנטריפוגלי (לאחר משיכה של חלבון A למטה)
יחידות מסנן צנטריפוגלי Amicon Ultra-4 50,000 NMWL	מרק	UFC805024	רכזי סינון צנטריפוגליים (לאחר טיהור FPLC או HPLC)
עמודי התפלת ספין Zeba, MWCO 7K, 0.5 מ"ל	ThermoFisherScientific	89882	עמודות סיבוב של אי הכללת גודל
צינור PCR 0.2ml מכסה שטוח	גדילן סיינטיפיק בע מ	AX-PCR-02-C-CS	צינורות PCR