כרומטוגרפיה של זיהוי פלואורסצנטיות של אי הכללת גודל: טכניקה לזיהוי שלמות חלבוני הממברנה הפלואורסצנטית בעת מסיסות חומרי ניקוי

תקציר

מקור: Bird, L. E., et al. בדיקת ביטוי מבוססת חלבון פלואורסצנטי ירוק של חלבוני ממברנה ב- Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של זיהוי גודל פלואורסצנטי כדי לסנן יציבות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-התיך חלבון ממברנה ב- Escherichia coli לאחר מסיסות חומרי ניקוי. חלבונים המציגים שיא סימטרי בפרופיל אי הכללת הגודל עם מעט או ללא GFP חופשי מצביעים על חלבונים מטוהרים עם מינימום פירוק וצבירה, אשר לאחר מכן ניתן לבחור אותם לניתוח מבנה-פונקציה.

פרוטוקול

1.מסיסות ואנליזה של מקטע הממברנה

1. להפשיר את מקטע הממברנה (במידת הצורך), וכדי שכל חומר ניקוי ישמש למסיסות, aliquot 900 μl של תרחיף הממברנה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה פוליאלומר 1.5 מ"ל.
2. הוסף 100 μl של כל חומר ניקוי טרי מוכן (10% w/v תמיסות של DDM, DM, Cymal-6 ו- LDAO) לריכוז סופי של 1% לצינור 1.5 מ"ל שצוין. עבור מסיסות של חלבוני קרום אאוקריוטי כולסטרול hemisuccinate (ריכוז סופי 0.2%) ניתן להוסיף את הדטרגנטים.
3. לדגור על התערובות ב 4 ° C במשך 1 שעה עם תסיסה קלה.
4. משחררים את החלק הבלתי מסיס של חומר הניקוי עם אולטרה-צנטריפוגה עליונה של ספסל, ומבטיחים שהצינורות יהיו לפחות חצי מלאים, ב-150,000 גרם ב-4°C למשך 45 דקות וישמרו על supernatant.
   הערה: ניתן להעריך את היעילות של מסיסות חומרי ניקוי באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי על ידי מדידת פלואורסצנטיות GFP של הממברנות המסיסות כאשר חלק הדטרגנט הבלתי מסיס מרחף מחדש באותו נפח של PBS.
5. לנתח את mono-dispersity של חומרי ניקוי שונים: קומפלקסים חלבון ממברנה באמצעות כרומטוגרפיה גודל זוהה פלואורסצנטי (FSEC).
6. עבור ניתוח FSEC, יש לאזן עמודת אי הכללת גודל עם טווח שברים רחב, לדוגמה, 5,000 עד 5,000,000 במשקל מולקולרי, עם חיץ פועל (20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.03% DDM) בקצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה. השתמש במאגר זה עבור כל הדגימות, כלומר, הוא אינו משתנה עבור כל חומר ניקוי שנבדק.
7. הזריקו 100 מיקרוליטר של ממברנות מסיסות על העמוד בקצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה. נטרו את פרופיל האלוציה באמצעות אופטיקה פלואורסצנטית (עירור ב-488 ננומטר ופליטה ב-512 ננומטר). אם צג פלואורסצנטי מוטבע אינו זמין, אסוף את השברים וקרא את הפלואורסצנטיות בקורא לוחות.
8. יבא נתוני נפח ועוצמת פלואורסצנטיות לתוכנית גיליון אלקטרוני לתצוגה גרפית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כולסטרול המיסוקצינאט	סיגמא-אולדריץ'	C6512
CYMAL-6 (6-ציקלוהקסיל-1-הקסיל-βD-מלטוזיד)	אנטרס	C326
DDM (n-דודציל β-מלטוזיד)	ג'נרון	D97002
DM (n-דציל β-מלטוזיד)	ג'נרון	D99003
LDAO (N,N-DIMETHYL-NDODECYLAMINE N-OXIDE)	ג'נרון	D71111
תקן חלבון פלואורסצנטי BenchMark	לייף טכנולוגיות	LC5928
Optima L-100 Ultracentrifuge פועל רוטור 45-Ti	בקמן קולטר	393253
Optima Max-XP ultracentrifuge פועל רוטור TLA-55	בקמן קולטר	393315
בולטות UFLC עם גלאי פלואורסצנטי RF-20A	שימאדזו
Sepharose 6 עמודת אי הכללה בגודל 10/300 GL	GE שירותי בריאות	17-5172-01