כרומטוגרפיית זיקה מבוססת DFE: טכניקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים 2F5 מדגימה גולמית באמצעות תנאי אלוציה מבוססי חוזק יוני גבוה

Abstract

מקור: Knödler, M. et al., Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים 2F5 באמצעות ליגנדות DsRed-2F5-Epitope או DFE. נוגדנים חד שבטיים מטוהרים 2F5 הם תרופות חיוניות באימונותרפיה.

Protocol

1. בדיקת טיהור mAbs מתמציות צמחים מזוקקים

1. הכינו 100 מ"ל של תמצית צמח מזוקק המכיל 2F55 או את הסופרנאטנט ממערכת הביטוי התאית המועדפת, המכילה גם 2F5.
2. הכנת חיץ שיווי משקל (20 מ"מ נתרן פוספט, 500 מ"מ נתרן כלורי, pH 7.4), חיץ אלוציה בעל pH נמוך (0.05 מ' ציטראט, 0.05 מ' נתרן כלורי, pH 4.0–3.25), וחיץ אלוציה בחוזק יוני גבוה (1.0–4.0 מ' מגנזיום כלורי, 0.1 מ' HEPES, pH 8.0)
3. שטפו את מערכת הכרומטוגרפיה עם החוצצים. הרכיבו עמודת זיקה DFE (עיין בטקסט הפרוטוקול הראשי) במערכת הכרומטוגרפיה ושיווי משקל עם 5 CV של מאגר שיווי משקל בקצב זרימה של 1.0 מ"ל ^{מינימום 1}. נטר את ספיגת UV ב 280 nm.
   הערה: העמסת תמצית צמח או תרבית תאים על העמוד עלולה לגרום לעלייה בלחץ הגב. הגדר התראת לחץ גבוה על 0.2 מגפ"ס כדי למנוע נזק למערכת הכרומטוגרפיה או לעמודת DFE.
4. טען 80 מ"ל של תמצית הצמח המזוקק או הסופרנאטנט (שלב 1.1) על העמוד בקצב זרימה של 0.5 מ"ל min-1 כדי להבטיח זמן מגע של 2 דקות. אסוף את דגימות הזרימה בשברים של 2 מ"ל לשחזור עקומה פורצת דרך. אחסן את הדגימות הזורמות ב- 4 ° C אם ניתוח דגימה מיידי אינו אפשרי.
5. שטפו את העמודה עם 6 קורות חיים של מאגר שיווי משקל. אספו דגימה של הכביסה בתחילתו, באמצעו ובסיומו של שלב זה.
6. Elute mAb 2F5 עם 5 CV של חיץ אלוציה בעל pH נמוך או חיץ אלוציה בחוזק יוני גבוה (0.1 M HEPES, 1.25 M מגנזיום כלורי, pH 8.0). אסוף את מקטע DFE כאשר אות UV 280 ננומטר גדל ל -5 mAU מעל קו הבסיס.
   1. מטב את מאגר האלוציה עבור כל זוג אפיטופים-נוגדנים. עבור 2F5, מגנזיום כלורי בנפח 1.25 מ' השיג איזון אופטימלי בין התאוששות המוצר ליציבות ליגנד.
      הערה: תמיסת מגנזיום כלוריד מועדת למשקעים. לכן, להמיס את מגנזיום כלוריד ~ 700 מ"ל של מים. בנפרד להמיס את HEPES ב 100 מ"ל של מים ולהתאים את ה- pH ל 8.0. הוסף את תמיסת המגנזיום כלוריד המומסת לתמיסת HEPES והוסף מים לנפח סופי של 1.0 ליטר. אין להתאים את ה- pH לאחר המסת מגנזיום כלורי כי זה יגרום משקעים.
7. נתח את כל הדגימות שנלקחו במהלך שלבים 1.4-1.6 באמצעות שיטת ברדפורד, אלקטרופורזה ג'ל ליתיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (LDSPAGE), וספקטרוסקופיית תהודה פלסמונית פני השטח (SPR).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsRed	Fraunhofe IME	לא ישים	סטנדרט
Sepharose HP המופעל על ידי HiTrap NHS, 1 מ"ל	GE Helthcare	17-0716-01	עמודות כרומטוגרפיה
HEPES	קרל רוט GmbH	9105.3	רכיב חיץ
מגנזיום כלורי	קרל רוט GmbH	KK36.2	רכיב חיץ
PH 3110	WTW	2AA110	מד pH
Sephadex G-25 דקסטרן דק ומקושר צולב	GE Helthcare	17003301	שרף כרומטוגרפיה
נתרן כלורי	קרל רוט GmbH	P029.2	רכיב חיץ
נתרן ציטראט	קרל רוט GmbH	HN13.2	רכיב חיץ