מאמר שיטה

בדיקת פעילות אנזימים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה: טכניקה לקביעת פעילות פירופוספוקינאז במבחנה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Pokhrel, A., et al. A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים בדיקת אנזים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה כדי לקבוע את פעילות פירופוספוקינאז באמצעות נוקלאוטידים בעלי תווית רדיו. השיטה מספקת תובנות לגבי סינתזת נוקלאוטידים ותגובות פוספוטרנספורט.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקת פעילות חלבונים לפי כרומטוגרפיה של שכבה דקה

  1. הכינו את לוח הכרומטוגרפיה של השכבה הדקה (TLC).
    1. הכינו צלחות פוליאתילנימין-תאית (PEI) על ידי שטיפה במים נטולי יונים. מניחים את הצלחות בתא זכוכית עם מים מזוקקים כפול לעומק של ~0.5 ס"מ.
    2. אפשר למים לנדוד לחלק העליון של הצלחת.
      הערה: שטיפת הצלחות אינה הכרחית לחלוטין, מכיוון שניתן להשתמש בצלחות בלעדיה, אך שטיפה מגבירה את בהירות התמונות המתקבלות. שטיפת הצלחות בשני כיוונים מאונכים מבטיחה עוד יותר שכל המזהמים שנמצאים בשרף מבודדים בפינה אחת של הצלחת (איור 1).
    3. הוציאו את הצלחות מתא הזכוכית והשאירו על מדף ספסל לייבוש למשך הלילה (12-18 שעות).
    4. סמן את הלוחות היבשים 2.0 ס"מ מקצה אחד עם עיפרון רך כדי לציין היכן הדגימות ייושמו עבור TLC. עבור דגימות של 2 μL, יש למרוח דגימות במרחק של לא פחות מ-1.0 ס"מ זו מזו (איור 1).
      הערה: הדבר מאפשר הפרדה ברורה בין נקודה סמוכה, שהיא קריטית לכימות אותות. כל עוד שרף התאית אינו שרוט, סימני עיפרון קטנים על פני השטח לא יפריעו לנדידת הממס.
    5. בעת תכנון ניסויים, תמיד להשאיר נקודה אחת על כל צלחת ללא שימוש.
      הערה: פעולה זו תספק נתיב ריק לכימות הדגימה (איור 1). צלחת TLC בקוטר 20 ס"מ תאפשר מקום ל-19 מקומות.
  2. בדיקת פעילות אנזימים
    1. הכינו תערובת חיץ 5x המכילה 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM אמוניום אצטט, 10 mM KCl, 1 mM DTT ו- 0.6 mM ATP (אדנוזין טריפוספט).
      הערה: תערובת זו עשויה להיות מוכנה בכמויות גדולות ולהקפיא ב 10 μL aliquots לשימוש מאוחר יותר. אין להכפיף את התערובת למספר מחזורי הקפאה-הפשרה.
    2. הכינו תגובות בודדות המכילות 3 מיקרומטר RSH (אנזימי הומולוג Rel/Spo), תערובת חיץ 1x, תמ"ג 0.6 מ"מ (גואנוזין דיפוספט), 1.2 מ"מ MgCl2. הוסף 1.0 μCi של γ-32P-ATP (ATP מסומן ברדיו) לכל 10 μL של תגובה והשתמש במים נטולי נוקלאז כדי להביא את התגובה לנפח הרצוי. הוסף את ה- RSH לאחר ערבוב הרכיבים האחרים, שכן הוספת RSH לתערובת המכילה נוקלאוטידים מתחילה את פעילות האנזימטית assay.
      הערה: נפח התגובה הסופי יהיה תלוי במספר נקודות הזמן שנדגמו. כדי לדגום 2 μL/נקודת זמן, הרכיבו 10 μL של תערובת תגובה עבור כל 4 נקודות זמן.
    3. כדי לשלוט בהידרוליזה של ATP מפעילות נוקלאז מזהמת, יש להרכיב תגובה של 10 μL שאינה מכילה חלבון ולדגור עליה במקביל. נקודתי 2 דגימות μL ב t = 0 ובסוף הניסוי כדי להבטיח כי ATP לא היה hydrolyzed בהיעדר חלבון.
    4. מיד עם הוספת RSH, הסר 2 μL ואתר אותו על צלחת PEI-cellulose המסומנת כדגימה t = 0 דקות.
    5. לדגור את התגובה ב 37 ° C, הסרת 2 μL aliquots בנקודות הזמן הרצויות.
      הערה: הפעילות האנזימטית תיפסק כאשר הדגימה נספגת על צלחת התאית. המתינו 10-30 דקות לאחר הוספת הכתם האחרון לצלחת לפני הפיתוח כדי להבטיח ספיחה מלאה וייבוש דגימה.
  3. כרומטוגרפיה של שכבה דקה
    1. מלא את תא הכרומטוגרפיה ב- 1.5 M 1.5 M KH2PO4 (pH 3.64) לעומק של 0.5 cm.
      הערה: הנפח הדרוש יהיה תלוי במידות מיכל הכרומטוגרפיה. כל מיכל זכוכית עם תחתית ישרה רחבה מספיק כדי לאפשר החדרה של צלחת TLC ללא כיפוף יכול לשמש כמיכל מתפתח עם תוספת של כיסוי. ניתן לחתוך את צלחת TLC לרצועות צרות יותר עם סכין גילוח נקי כדי לאפשר התפתחות בכוס זכוכית מכוסה בסרט פלסטיק.
    2. לטבול את הקצה התחתון של הצלחת בממס. אפשר לממס לנדוד לחלק העליון של הצלחת (~ 90 דקות).
      הערה: בעוד נדידת הממס תיעצר בחלק העליון של הצלחת והדגימות לא יאבדו או ירוצו יחד במהלך טבילה ארוכה יותר, אין להשאיר צלחות בממס למשך הלילה. טבילות ארוכות יותר מ-4 שעות עלולות לגרום לשרף להתנתק מגב הצלחת ולגרום לאובדן אות.
    3. הסר את הצלחת ממיכל הכרומטוגרפיה והנח אותה על מדף ייבוש ספסל.
    4. הניחו לצלחת להתייבש באוויר למשך הלילה.
      הערה: ניתן להאיץ את הייבוש באמצעות מייבש שיער. ניתן להעריך יובש על ידי צבע השרף, אשר יתכהה כאשר הוא רטוב ויחזור לצבע של צלחת שאינה בשימוש כאשר הוא יבש לחלוטין.
    5. לאחר שהצלחת יבשה, עטפו את הצלחת בסרט פלסטיק כדי למנוע העברה של חומר רדיואקטיבי לקלטת ההדמיה ונתחו אותה באמצעות אוטורדיוגרפיה (איור 2).
  4. ניתוח נתונים
    1. חשוף את צלחת PEI-cellulose המכילה תגובות מופרדות לקלטת זרחן במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
      הערה: זוהי חשיפה מספקת כדי להניב תמונה ברורה מאוד באמצעות הריכוזים המצוינים של γ-32P-ATP טרי. אם נעשה שימוש בכמויות נמוכות יותר של מצע עם תווית רדיו, ניתן להגדיל את זמן החשיפה ל 12-16 שעות.
    2. דמיינו את הקלטת על זרחן.
    3. באמצעות תוכנת הדמיה עם ממשק משתמש גרפי, צייר אזורי עניין (ROIs) על-ידי בחירה באפשרות צייר מלבן ושימוש בעכבר כדי לצייר ROI מלבניים סביב נתיב שלם אחד ונקודות ATP ו-ppGpp (טטרפוספט גואנוזין) הכלולות בתוך נתיב זה (איור 2).
    4. השתמש בפקודות בחירה, העתקה והדבקה (או פקודות מתאימות המבוססות על תוכנת ההדמיה שבשימוש) כדי לצייר החזר השקעה זהה בתוך הנתיבים האחרים כדי להבטיח שהחזר ההשקעה מודד אות באזורים זהים בכל נתיב. כלול החזר השקעה מנתיב שאינו בשימוש, שישמשו כריקים.
    5. שימוש בניתוח | כלים | מנהל החזר השקעה | הוסף פקודות של תוכנת ההדמיה, בחר את כל ה- ROI שצוירו על לוח התאית PEI.
    6. שימוש בניתוח | הגדרת מידות | מדוד פקודות, כמת את עוצמת האות בתוך כל החזר השקעה וייצא את המדידות כגיליון אלקטרוני (איור 2). הפחתת ערכי ROI ריקים מאותות ניסיוניים.
      figure-protocol-1
    7. חשב איזה אחוז מהאות הריק בתוך כל נתיב מיוחס ל- ATP ו- ppGpp באמצעות הנוסחאות.
      הערה: ניתן לצייר ולכמת את החזר ההשקעה באמצעות תוכנה מסחרית התואמת ל-phosphorimager או תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי (המכונים הלאומיים לבריאות).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: הכנת לוחות TLC. (A) הצלחות נשטפות בממד אחד על-ידי הנחת הקצה התחתון במים (כחול). מזהמים (צהובים) נודדים לחלק העליון של הצלחת עם הממס. (B) לאחר ייבוש מלא של פלטה, שוטפים אותה בממד שני על-ידי סיבובה ב-90° ביחס לשטיפה הראשונה ושוב מאפשרים למים לנדוד לחלק העליון של הצלחת. (C) לאחר השטיפה, כל המזהמים מבודדים בפינה אחת של הצלחת. ניתן לסמן בעדינות את השרף של צלחת TLC שטופה בעיפרון רך כדי לציין היכן יש ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיכל פיתוח כרומטוגרף שכבה דקה (TLC)חברת ניפוח זכוכית כללית80-3
לוחות פוליאתילנימין (PEI)-תאית (20 ס"מ x 20 ס"מ, עובי 100 מיקרומטר) עם תמיכה בפוליאסטרסיגמא-אולדריץ'Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml עופרת, 100 μCiפרקין אלמרNEG002A
אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP) 100 מילימולBio Basic קנדהAB0311
Guanosine-5'-diphosphate מלח דיסודיום (תמ"ג)אלפא עזרAAJ61646MC/E
מסך זרחן אחסוןGE Healthcare מדעי החייםמסך BAS-IP TR 2040 E Tritium
Storm 860 phosphorimagerGE Healthcare מדעי החיים-

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Radiolabeled ATPGuanosine TetraphosphatePEI Cellulose PlateAutoradiography AnalysisPhosphorimager ImagingReaction Mixture PreparationTime Point Sampling

מאמרים קשורים