$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. כרומטוגרפיית שכבה דקה בעלת ביצועים גבוהים (HPTLC) לכימות למחצה של כמות מספר שומנים, כולל כולסטרול, פוספוליפידים וספינגומיילין
- הכינו את ארבעת פתרונות הריצה והצביעה הבאים.
- פתרון 1: ערבבו אתיל אצטט (26.6%), 1-פרופנול (26.6%), כלורופורם (26.6%), מתנול (26.6%) ואשלגן כלורי (9.6%). הכן את KCl על ידי המסת 0.25 גרם KCl ב-100 מ"ל מים באיכות HPLC.
- פתרון 2: ערבבו n-הקסאן (73%), אתר דיאתיל (23%) וחומצת לימון (2%).
- פתרון 3: 100% n-הקסאן.
- הכן את פתרון הצביעה על ידי ערבוב מים מזוקקים (90 מ"ל) עם 7.5 גרם של נחושת גופרתית, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של חומצה זרחתית.
- מלאו עד 5 מ"מ מכל תמיסה בתא זכוכית נפרד. הוסף כל סוג של נייר סינון כדי להגביר את מהירות ההפעלה בכל תא.
- יש לדגור מראש פלטת זכוכית HPTLC ג'ל סיליקה 60 בגודל 20X10 ס"מ בתמיסת הריצה הראשונה עד שתמיסת הריצה מגיעה לחלק העליון של הצלחת. לאחר מכן יבש אותו במשך 10 דקות ב 110 ° C.
הערה: ניתן לאחסן לוחות אלה לשימוש עתידי ברדיד אלומיניום ולייבש אותם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 110°C לפני השימוש.
- יש להמיס גלולת שומנים המתקבלת מנויטרופילים אנושיים שמקורם בדם היקפי ב-200 מיקרוליטר של תמיסת כלורופורם/מתנול (1:1) ולדגור במשך 15 דקות ב-37°C כדי להתמוסס.
- השתמשו בסרגל ובעיפרון רך כדי לסמן את נקודות הטעינה למספר הדגימות הרצוי, בתוספת תקן אחד לפחות. סמן את מרחק הריצה בכ- 4 ס"מ ו- 6 ס"מ עבור פתרון הריצה הראשון והשני, בהתאמה.
- כדי לטעון את הדגימות, שטפו את מזרק 10 μL 3 פעמים בכלורופורם/מתנול (1:1) לפני טעינת כל דגימה חדשה. טען 10 μL של כל דגימה טיפה, מנסה לרכז את הדגימה על שטח קטן ככל האפשר. דוגמאות יש לטעון לפחות בכפילויות.
- הניחו את הצלחת במאונך לתוך התא הראשון עם פתרון פועל 1 (שלב 1.1.1). ודא שהלוח מקביל לדופן תא הזכוכית כדי להשיג מהירות נדידה אחידה.
- לאחר שקו הממס הגיע לסימן הראשון, הסירו את הצלחת, ייבשו אותה והניחו אותה בתמיסה השנייה. חזור על שלבים דומים עבור הפתרונות השני והשלישי הפועלים; השאירו את הצלחת בתמיסה עד שחזית הממס תגיע לחלק העליון של הצלחת, ואז הסירו וייבשו אותה ב-RT למשך דקה אחת.
- מניחים את הצלחת בתמיסת נחושת גופרתית למשך 7 שניות. מוציאים את הצלחת, מייבשים אותה היטב ואופים בתנור במשך 7 דקות בחום של 170°. מחכים שהצלחת תתקרר.
- באמצעות תוכנת ניתוח כרומטוגרפיה וג'ל בשכבה דקה, כמו גם תוכנת עיבוד תמונה, סרוק ונתח כדי לזהות את רצועות השומנים שנפתרו.