כרומטוגרפיית שכבה דקה בעלת ביצועים גבוהים: טכניקה להפרדה ראשונית וכימות של שומנים מנויטרופילים

תקציר

מקור: Brogden, G., et al. שיטות לחקר שינויים ליפידים בנויטרופילים והיווצרות לאחר מכן של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים טכניקה להפרדה ראשונית וכימות של שומנים מנויטרופילים אנושיים שמקורם בדם. טכניקה זו מסייעת בהערכה הראשונית של אנליטות המטרה לפני שתמשיך עם HPLC.

פרוטוקול

1. כרומטוגרפיית שכבה דקה בעלת ביצועים גבוהים (HPTLC) לכימות למחצה של כמות מספר שומנים, כולל כולסטרול, פוספוליפידים וספינגומיילין

1. הכינו את ארבעת פתרונות הריצה והצביעה הבאים.
   1. פתרון 1: ערבבו אתיל אצטט (26.6%), 1-פרופנול (26.6%), כלורופורם (26.6%), מתנול (26.6%) ואשלגן כלורי (9.6%). הכן את KCl על ידי המסת 0.25 גרם KCl ב-100 מ"ל מים באיכות HPLC.
   2. פתרון 2: ערבבו n-הקסאן (73%), אתר דיאתיל (23%) וחומצת לימון (2%).
   3. פתרון 3: 100% n-הקסאן.
   4. הכן את פתרון הצביעה על ידי ערבוב מים מזוקקים (90 מ"ל) עם 7.5 גרם של נחושת גופרתית, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של חומצה זרחתית.
2. מלאו עד 5 מ"מ מכל תמיסה בתא זכוכית נפרד. הוסף כל סוג של נייר סינון כדי להגביר את מהירות ההפעלה בכל תא.
3. יש לדגור מראש פלטת זכוכית HPTLC ג'ל סיליקה 60 בגודל 20X10 ס"מ בתמיסת הריצה הראשונה עד שתמיסת הריצה מגיעה לחלק העליון של הצלחת. לאחר מכן יבש אותו במשך 10 דקות ב 110 ° C.
   הערה: ניתן לאחסן לוחות אלה לשימוש עתידי ברדיד אלומיניום ולייבש אותם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 110°C לפני השימוש.
4. יש להמיס גלולת שומנים המתקבלת מנויטרופילים אנושיים שמקורם בדם היקפי ב-200 מיקרוליטר של תמיסת כלורופורם/מתנול (1:1) ולדגור במשך 15 דקות ב-37°C כדי להתמוסס.
5. השתמשו בסרגל ובעיפרון רך כדי לסמן את נקודות הטעינה למספר הדגימות הרצוי, בתוספת תקן אחד לפחות. סמן את מרחק הריצה בכ- 4 ס"מ ו- 6 ס"מ עבור פתרון הריצה הראשון והשני, בהתאמה.
6. כדי לטעון את הדגימות, שטפו את מזרק 10 μL 3 פעמים בכלורופורם/מתנול (1:1) לפני טעינת כל דגימה חדשה. טען 10 μL של כל דגימה טיפה, מנסה לרכז את הדגימה על שטח קטן ככל האפשר. דוגמאות יש לטעון לפחות בכפילויות.
7. הניחו את הצלחת במאונך לתוך התא הראשון עם פתרון פועל 1 (שלב 1.1.1). ודא שהלוח מקביל לדופן תא הזכוכית כדי להשיג מהירות נדידה אחידה.
8. לאחר שקו הממס הגיע לסימן הראשון, הסירו את הצלחת, ייבשו אותה והניחו אותה בתמיסה השנייה. חזור על שלבים דומים עבור הפתרונות השני והשלישי הפועלים; השאירו את הצלחת בתמיסה עד שחזית הממס תגיע לחלק העליון של הצלחת, ואז הסירו וייבשו אותה ב-RT למשך דקה אחת.
9. מניחים את הצלחת בתמיסת נחושת גופרתית למשך 7 שניות. מוציאים את הצלחת, מייבשים אותה היטב ואופים בתנור במשך 7 דקות בחום של 170°. מחכים שהצלחת תתקרר.
10. באמצעות תוכנת ניתוח כרומטוגרפיה וג'ל בשכבה דקה, כמו גם תוכנת עיבוד תמונה, סרוק ונתח כדי לזהות את רצועות השומנים שנפתרו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1-פרופנול	סיגמא-אולדריץ'	33538
מזרק 10 μL	המילטון	701 NR 10 μl
אתר דיאתיל	סיגמא-אולדריץ'	346136
אתיל אצטט	קרל רות'	7336.2
נחושת(II)סולפטפנטהידראט	מרק	1027805000
כלורופורם	קרל רות'	7331.1
תוכנת CP ATLAS	Lazarsoftware	2
מתנול	קרל רות'	7342.1
n-הקסאן	קרל רות'	7339.1
חומצה זרחתית	סיגמא-אולדריץ'	30417
אשלגן כלורי	מרק	49,361,000
HPTLC ג'ל סיליקה 60	מרק	105553