אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד: טכניקה אנליטית לזיהוי הפראן סולפטים באורכי שרשרת משתנים שבודדו מרקמת הריאה של עכבר

תקציר

מקור: LaRiviere, W. B. et al., Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את הליך ההפרדה של סולפטים הפרניים שבודדו מרקמת הריאה של עכבר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.

פרוטוקול

1. אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד של גליקוזאמינוגליקנים מבודדים ומטוהרים

1. הכן מראש את התמיסות הדרושות לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE) (טבלה 1).
   הערה: בחר את אחוז האקרילאמיד של פתרון תמיסת ג'ל בהתאם לגודל הגליקוזאמינוגליקנים הצפויים להיות בדגימה. 15% מומלץ לפתרון שברים גדולים יותר (יותר מ -30 תת-יחידות דו-סוכר באורך); 22% עבור שברים קטנים יותר (<20 תת-יחידות דו-סוכריות באורך).
2. הכנס את הקלטת הריקה למיכל PAGE. יצקו את ג'ל הפתרון כדלקמן: בצינור 15 מ"ל, מערבבים 10 מ"ל של תמיסת ג'ל פתרון, 60 μL של 10% אמוניום פרסולפט (חייב להיות מוכן טרי), ו 10 μL של TEMED (להוסיף TEMED האחרון). הפוך את הצינור בעדינות 2-3x. השתמש פיפטה כדי להוסיף במהירות את הפתרון לעיל 10 מ"ל קלטת. כיסוי עם 2 מ"ל של מים מסוננים deionized, ולאפשר את ג'ל resolving להתפלמר במשך 30 דקות.
   הערה: פרוטוקול PAGE הבא עבר אופטימיזציה למערכת PAGE אנכית באמצעות קסטות יציקה בעובי 13.3 x 8.7 ס"מ (רוחב x אורך) בעובי 1.0 מ"מ בנפח כולל של כ-12 מ"ל. ניתן להשתמש במערכות קלטות אחרות אך עשויות לדרוש אופטימיזציה על ידי משתמש הקצה.
3. לאחר שג'ל הפירוק עבר פולימריזציה מלאה, יש להשליך את המים השכובים ולהטיל את ג'ל הערימה באופן הבא: בצינור של 15 מ"ל, לערבב 3 מ"ל של תמיסת ג'ל הערימה, 90 μL של 10% אמוניום פרסולפט (חייב להיות מוכן טרי), 3 μL של TEMED (להוסיף TEMED אחרון).
4. הפוך את הצינור בעדינות 2-3x. השתמש פיפטה כדי להוסיף במהירות את תמיסת ג'ל הערימה על ג'ל פתרון מוצק; מלאו את הקסטה עד אפס מקום. הכנס את המסרק במלואו הכלול בהגדרה. תנו לג'ל הערימה להתפלמר למשך 30 דקות.
5. לאחר שהג'ל עבר פולימריזציה, ודא שרצועת הסרט הוסרה מתחתית הקלטת, והחזיר את הקלטת למכלול מיכל PAGE.
6. מלאו את החדרים העליונים והתחתונים במאגר התא העליון והתחתון, בהתאמה.
7. להמיס את הדגימות המיובשות משלב 1.11.4 בנפח המינימלי הדרוש של מים מסוננים ונטולי יונים, (לכל היותר, 50% מנפח הבארות בג'ל PAGE). ערבבו 1:1 עם מאגר טעינת דגימה. טען את הדגימות ואת "סולמות" אוליגוסכריד HS (ראה טבלה 1) לתוך הג'ל.
8. הפעל מראש את הג'ל במשך 5 דקות ב 100 V. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 200 V במשך 20-25 דקות (עבור 15% פוליאקרילאמיד פתרון ג'ל), 40-50 דקות (עבור 18% פוליאקרילאמיד פתרון ג'ל), 90-100 דקות (עבור 22% פוליאקרילאמיד פתרון ג'ל).
   הערה: ייתכן שיהיה צורך במיטוב מסוים של זמן הריצה של 200 וולט. פנול אדום נודד לפני אוליגוסכרידים הפרין כי הם 2 יחידות פולימר באורך (כלומר, דרגת פילמור 2, או dp2); Bromophenol Blue נודד לפני DP10-DP14. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר המתח מוחל כך שהפס האדום פנול נודד כמעט, אך לא ממש, לתחתית הג'ל. התאם את זמן הפעולה בהתאם.

תוצאות

טבלה 1: פתרונות הדרושים לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד של גליקוזאמינוגליקנים מטוהרים. יש לסנן את כל התמיסות (0.22 מיקרומטר) לפני השימוש.

הערה: יש לסנן את כל התמיסות (0.22μm) לפני השימוש.
תמיסה	מתכון	הרכב	הערות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמוניום פרסולפט (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	BP179-25	דרגת אלקטרופורזה
מערכת טיהור מים Barnstead GenPure Pro	תרמופישר סיינטיפיק	10-451-217PKG	כל מערכת דה-יוניזציה/טיהור מים היא תחליף מקובל
חומצה בורית (מוצקה)	תרמופישר סיינטיפיק	A73-500	כיתה ביולוגיה מולקולרית
ברומפנול כחול (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	B392-5
קריטריון קסטה ריקה עבור PAGE (1.0 מ"מ עובי, 12+2 בארות)	ביו-ראד	3459901	כל מערכת קסטות יציקת PAGE בעובי 1.0 מ"מ תספיק
קריטריון PAGE מערכת תאים (תא וספק כוח)	ביו-ראד	1656019	כל מערכת PAGE ג'ל אנכית דומה תעבוד)
מלח דיסודיום EDTA (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	02-002-786	כיתה ביולוגיה מולקולרית
גליצין (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	G48-500	דרגת אלקטרופורזה
חומצה הידרוכלורית (נוזלית)	תרמופישר סיינטיפיק	A466-250
N,N'-methylene-bis-acrylamide (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	BP171-25	דרגת אלקטרופורזה
פנול אדום (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	עמ' 74-10	חומצה חופשית
סוכרוז (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	BP220-1	כיתה ביולוגיה מולקולרית
TEMED (N,N,N',N',N'-tetramethylenediamine)	תרמופישר סיינטיפיק	BP150-20	דרגת אלקטרופורזה
בסיס תריס (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	BP152-500	כיתה ביולוגיה מולקולרית
יחידת מסנן ואקום, לשימוש חד-פעמי, PES נקבוביות 0.22uM, נפח 500 מ"ל	תרמופישר סיינטיפיק	569-0020	נפחים חלופיים וחומרי סינון מקובלים
אקרילאמיד (מוצק)	תרמופישר סיינטיפיק	BP170-100	דרגת אלקטרופורזה
הפרין נגזר decasaccharide (dp10)	גאלן סיינטיפיק	HO10
הפרין נגזר hexasaccharde (dp6)	גאלן סיינטיפיק	HO06
אוליגוסכריד המופק מהפרין (dp20)	גאלן סיינטיפיק	HO20