נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

תקציר

מקור: Sultana, S. et al. מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבוניים לאחר טיפול ב- Escherichia coli עם גורם עקה פרוטאוטווקסי. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

פרוטוקול

1. הפרדה והדמיה של אגרגטים חלבוניים שחולצו באמצעות SDS-PAGE

1. הכנת ג'ל 12% SDS-פוליאקרילאמיד
   1. עבור שני ג'לים נפרדים, פיפטה 5.1 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים (ddH 2 O), 3.75 מ"ל של Tris-HCl (pH_8.8), 7.5 מ"ל של 20% (w/v) SDS, 6 מ"ל של 30% תמיסת אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1), 75 מ"ל של 10% w/v אמוניום פרסולפט, ו-10 מ"ל של טטרמתילאתילאנדיאמין (TEMED) לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ולערבב בעדינות מבלי להכניס בועות אוויר. יוצקים את הג'ל באמצעות צינור 1 מ"ל בתוך לוחות הזכוכית, ומשאירים את 2 הס"מ העליונים נקיים מהתערובת. מוסיפים 70% אתנול בחלק העליון של ג'ל ההפרדה ומאפשרים ממשק אחיד בין שתי השכבות.
   2. לאחר פילמור של ג'ל ההפרדה, להכין את ג'ל הערימה על ידי pipetting 1.535 מ"ל של ddH₂O, 625 מ"ל של Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 מ"ל של 20% (w/v) SDS, 335 מ"ל של 30% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29: 1) תמיסה, 12.5 מ"ל של 10% w/v אמוניום פרסולפט, ו 2.5 מ"ל של TEMED. הסר את האתנול מהג'לים המפרידים והוסף את תמיסת ג'ל הערימה. הכנס מסרק עם מספר הכיסים הרצוי מבלי להכניס בועות אוויר. אפשר פילמור למשך 20-30 דקות.
2. יש להעמיס 4 μL מכל דגימה וסולם חלבונים לבארות נפרדות ולהפעיל את הג'ל(ים) במאגר הריצה Tris-Glycine (טבלה 1) במתח של 144 וולט למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הפסיקו את השימוש בג'ל כאשר רצועת הברומופנולים עומדת לנדוד החוצה מהג'ל.
3. הכתימו את הג'ל(ים) בתמיסת פיירבנקס A שחוממה מראש (טבלה 1) למשך 30 דקות על נדנדה.
4. צבעו את הג'ל(ים) בתמיסת פיירבנקס שחוממה מראש D (טבלה 1) עד לרקע הרצוי (למשל, לילה) על נדנדה.

תוצאות

פתרונות	מתכונים
חיץ א'	10 מ"מ אשלגן פוספט (pH 6.5), 1 מ"מ EDTA
חיץ B	חיץ A המכיל 2% Nonidet P-40. ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר.
פיירבנקס A (פתרון צביעה)	25% איזופרופנול, 10% חומצה אצטית קרחונית, 1.4 גרם קומאסי R-250
Fairbanks D (תמ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כימיקלים/ריאגנטים
אצטון	פישר סיינטיפיק	67-64-1
30% תמיסת אקרילאמיד/ביסאקרילאמיד 29:1	ביו-ראד	1610156
אמוניום פרסולפט	מיליפור סיגמא	A3678-100G
Bluestain 2 סולם חלבונים, 5-245 kDa	גולדביו	P008-500
β-מרקפטואתנול	מיליפור סיגמא	M6250-100ML
ברומופנול כחול	גולדביו	B-092-25
קומאסי כחול מבריק R-250	MP Biomedicals LLC	821616
אתילאנדיאמין טטרה חומצה אצטית (EDTA)	סיגמא-אולדריץ'	SLBT9686
חומצה אצטית קרחונית	מיליפור סיגמא	ARK2183-1 ליטר
גליצרול, 99%	סיגמא-אולדריץ'	G5516-1L
גליצין	גולדביו	G-630-1
איזופרופנול (2-פרופנול)	סיגמא	402893-2.5 ליטר
10x MOPS Buffer	טקנובה	M2101
סודיום דודציל סולפט (SDS)	סיגמא-אולדריץ'	L3771-500G
טטרמתילאתילאנדיאמין (TEMED)	מיליפור סיגמא	T9281-50ML
בסיס טריס	גולדביו	T-400-1
חומר/ציוד
ספק כוח	תרמופישר סיינטיפיק	EC105
רוקר	אלקלי סיינטיפיק	RS7235
צלחת זכוכית קטנה	ביו-ראד	1653311
לוחות ספייסר (1 מ"מ)	ביו-ראד	1653308
ספקטרופוטומטר	תרמוסיינטי	3339053
צנטריפוגה שולחנית לצינורות צנטריפוגות 15 מ"ל	בקמן-קולטר
תא אלקטרופורזה ג'ל אנכי	ביו-ראד	1658004
וורטקסר	פישר וורטקס ג'יני 2	12-812
תרמומיקסר	בנצ'מרק סיינטיפיק	H5000-HC
10 מסרק באר	ביו-ראד	1653359