דנטורינג אוריאה פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח RNA: טכניקה להפרדת אוליגונוקלאוטידים של RNA עם תווית פלואורסצנטית מהמקבילות הלא זרחניות שלהם

תקציר

מקור: Pillon, M. C., et al., Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורינג להפרדת מיני RNA פוספורילציה מעמיתיהם שאינם פוספורילטים. מיני הרנ"א מסומנים באופן פלואורסצנטי לזיהוי לייזר על הג'ל.

פרוטוקול

1. אלקטרופורזה בג'ל

1. להכין 15% אקרילאמיד/תמיסת ג'ל אוריאה 8 M.
   זהירות: אקרילאמיד חייב להיות מטופל בזהירות, כי זה נוירוטוקסין. יש ללבוש תמיד כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן בעת הטיפול בו.
   1. בכד זכוכית של 150 מ"ל, ערבבו 22.5 מ"ל של תמיסת 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד 29:1 מעורבבת מראש, 6 מ"ל של 10x TBE, 28.8 גרם של אוריאה ומים נטולי RNase לנפח כולל של 59 מ"ל. מערבבים בעדינות את התמיסה.
      הערה: בהתאם לאורך מצע RNA, שינוי אחוז polyacrylamide עשוי לשפר את הרזולוציה בין RNA unphosphorylated ו phosphorylated.
   2. כדי להמיס את האוריאה, חממו את התמיסה במיקרוגל במשך 20 שניות, ערבבו את הנוזל ומיד החזירו את התמיסה למיקרוגל למשך 20 שניות נוספות. ערבבו בעדינות את התמיסה עד שהאוריאה מתמוססת לחלוטין.
   3. קררו את התמיסה באיטיות על ידי הכנסת הזכוכית לאמבט מים רדודים המכיל מים קרים. ודא כי רמת המים הקרים המקיפים את הזכוכית היא מעל רמת התמיסה בתוך הזכוכית. זה יקדם העברת חום יעילה. חכו 5 דקות
      הערה: אל תמשיך עם פרוטוקול זה אם הזכוכית מרגישה חמימה; המים צריכים להיות מתחת 25 °C (75 °F). אם זה עדיין מרגיש חם לאחר 5 דקות, ואז להחליף את המים באמבט המים עם מים קרים טריים ולחכות עוד 5 דקות.
   4. סנן ונטרל את התמיסה באמצעות יחידת סינון חד פעמית של 0.22 מיקרומטר להסרת חלקיקים ובועות אוויר מיקרוסקופיות.
2. יוצקים את ג'ל denaturing
   1. השתמשו בסבון ומים חמימים לניקוי צלחת זכוכית קצרה וארוכה המיועדת לג'לים במידות כוללות של 31.0 ס"מ x 38.5 ס"מ. רססו כל צלחת זכוכית באתנול 95% ונגבו את הכוס כדי להסיר לחות.
      הערה: אחת משתי הצלחות ניתנת לסיליקון כדי למנוע נזק לג'ל בעת הפרדת כריך צלחת הזכוכית. עם זאת, שלב זה אינו הכרחי מכיוון שפרוטוקול זה נועד לדמיין את הרנ"א מבלי להפריד את לוחות הזכוכית.
   2. הניחו את צלחת הזכוכית הארוכה בצורה אופקית על גבי קופסה כך שהיא מוגבהת מהספסל.
      זהירות: אקרילאמיד הוא רעיל, ולכן תחנת המזיגה של הג'ל חייבת להיות מכוסה בנייר ספסל שיכול לספוג כל נוזל שנשפך ולהיות ממוקם מיד בשקית אשפה לאחר השלמת ההליך.
   3. הניחו מרווח נקי של 0.4 מ"מ לאורך הקצוות הארוכים של לוח הזכוכית הארוך.
   4. הניחו את צלחת הזכוכית הקצרה על גבי הצלחת הארוכה וודאו שהקצוות של הצלחת הקצרה, הצלחת הארוכה והספייסרים מיושרים. הדקו כל צד באמצעות שלושה מלחציים מתכתיים במרווחים שווים.
   5. הוסף 24 μL של TEMED לתמיסת 15% אקרילאמיד/8 M אוריאה שהוכנה בשלב 3.1 וערבב את התמיסה.
   6. הוסף 600 μL של 10% (w/v) APS לתמיסה בשלב 1.2.5 וערבב בעדינות את התמיסה.
   7. מיד לשפוך את הפתרון בין לוחות זכוכית.
      הערה: כדי למנוע בועות, הקש על הכוס בזמן שהפתרון נמזג.
   8. מוסיפים בזהירות מסרק נקי, 0.4 מ"מ, 32 היטב לחלק העליון של כריך צלחת הזכוכית.
   9. המתן לפחות 30 דקות לאקרילאמיד להתפלמר.
3. הפעל את ג'ל denaturing
   1. הגדר את בלוק החום ל 75 ° C.
   2. הסירו את מהדקי המתכת המחזיקים את כריך צלחת הזכוכית יחד ושטפו וייבשו היטב את כריך צלחת הזכוכית.
   3. מניחים את כריך צלחת הזכוכית לתוך מכשיר הג'ל כאשר הצלחת הקצרה פונה פנימה.
   4. הכן מאגר ריצה של 0.5x TBE על ידי שילוב של 100 מ"ל של 10x TBE עם מים נטולי RNA של 1.9 ליטר. הוסף 600 מ"ל של חיץ הריצה לחדרים העליונים והתחתונים של מכשיר הג'ל.
   5. מוציאים בעדינות את המסרק ושוטפים היטב את הבארות באמצעות מזרק. הערה: שלב זה הוא קריטי להסרת אוריאה מהבארות.
   6. הפעל מראש את הג'ל למשך 30 דקות ב- 50 W. המתח הוא כ- 2,000 V. זהירות: מכשיר ג'ל זה פועל בהספק גבוה ועל המשתמשים להפגין זהירות.
   7. שוטפים היטב את הבארות באמצעות מזרק.
      הערה: שלב זה הוא קריטי אפילו להעמסת דגימה לבארות.
   8. דופק לסובב את התגובות מרוות. לאחר מכן לדגור את הצינורות ב 75 ° C במשך 3 דקות. חזור על סיבוב הדופק.
   9. מיד לטעון 10 μL של מדגם לכל באר ולהפעיל את הג'ל במשך 3 שעות ב 50 W.
      הערה: RNA המסומן פלואורסצנטית הוא רגיש לאור; לכן, לכסות את מנגנון הג'ל עם נייר כסף.
4. דמיינו את ג'ל הדנטורינג.
   1. כבה את ספק הכוח ונקז את החדר העליון של מנגנון הג'ל.
   2. שטפו וייבשו את הצד החיצוני של כריך צלחת הזכוכית באמצעות מים וסבון. מכסים את כריך צלחת הזכוכית בנייר כסף בזמן הובלת הג'ל.
   3. הרכיבו את כריך צלחת הזכוכית על במה של סורק לייזר המסוגל לזיהוי פלואורסצנטי כמותי ורגיש.
      הערה: ג'ל זה דק במיוחד לרזולוציה מקסימלית. מסיבה זו, פרוטוקול זה נועד למנוע את הקשיים של הסרת הג'ל מכריך צלחת הזכוכית על ידי הדמיה ישירה של RNA המסומן פלואורסצנטית דרך לוחות הזכוכית. השימוש בלוחות זכוכית בעלי פלואורסצנטיות נמוכה הזמינים באופן מסחרי יגדיל את האות שנלכד על ידי שיפור יחס האות לרעש.
   4. הגדר את אורכי גל העירור והפליטה של סורק הלייזר עבור הפלואורופור הרצוי.
      הערה: אורכי גל העירור והפליטה האופטימליים עשויים להיות שונים עבור פלואורופורים ספציפיים. עבור פלואורופור FAM, אורכי גל העירור והפליטה הם 495 ננומטר ו- 535 ננומטר, בהתאמה.
   5. הגדירו את האזור שיש להמחיש בשלב סורק הלייזר ודמיינו את הג'ל בהתאם להוראות היצרן (איור 1).

תוצאות

איור 1: דוגמה לניתוח ג'ל דנטורינג של RNA פוספורילציה. בדיקת RNA קינאז במבחנה של Las1-Grc3 (110 nM) מודגרת עם 500 nM SC-ITS2 RNA. X מסמן את תגובת הבקרה ללא Las1-Grc3 והמשולש השחור מייצג את הטיטרציה של ATP בין 0-10 מילימול. C2 RNA הוא תוצאה של פיצול RNA SC-ITS2 על ידי נוקלאז Las1 והוא המ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.4 מ"מ מסרק 34 בארות	BioRad	1653848
מרווח 0.4 מ"מ	BioRad	1653812
0.5 מטר EDTA ph 8.0	KD מדיקל	RGF-3130
1M מגנזיום כלוריד	KD מדיקל	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD מדיקל	RGF-3360
40% תמיסת אקרילאמיד/ביס 29:1	BioRad	1610146
5M נתרן כלורי	KD מדיקל	RGF-3720
אמוניום פרסולפט (APS)	BioRad	161-0700
ATP	סיגמא	A2383-1G
חומצה בורית	סיגמא	B0394
ברומופנול מלח נתרן כחול	סיגמא	B5525-5G
צלחות זכוכית	תומאס סיינטיפיק	1188K51
רצף Hoefer SQ3	הופר	לא ישים
תוכנת Image J	לא ישים	לא ישים	https://imagej.nih.gov/ij/
אוליגונוקלאוטידים של RNA מסומנים	IDT	הזמנה מותאמת אישית
ספק כוח Pharmacia EPS 3500	בית מרקחת	לא ישים
סטריפליפ 0. 22 אום פילטר	מיליפור	5FCP00525
טמד	BioRad	161-0800
בסיס טריס	סיגמא	טריס-רו
Typhoon FLA 9500 ג'ל imager	GE שירותי בריאות	לא ישים
מי DEPC טהורים במיוחד	Invitrogen	750023
גליצרול טהור במיוחד	Invitrogen	19E1056865
אוריאה	פישר כימיקלים	U15-500