אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

תקציר

מקור: Hanna-Addams, S., et al. שימוש באלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז דנטורציה למחצה כדי לאשר הטרוגניות בגודל של סיבים דמויי עמילואיד או עמילואיד. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את ההפרדה הדו-ממדית המבוססת על אלקטרופורזה של סיבי עמילואיד, ג'ל אגרוז. הטכניקה מפרידה את צברי העמילואיד הפולימורפיים בהתבסס על גודלם ההטרוגני.

פרוטוקול

1. הכנת דוגמאות

1. תרבית 2 x 10⁶ עמילואיד המייצר תאי סרטן המעי הגס HT-29 בצלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ ב 10 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי ופניצילין-סטרפטומיצין. תאי תרבית לילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   1. לאחר שהתאים גדלים למפגש של 80%, שטפו את התאים עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). מוסיפים 3 מ"ל של תמיסת טריפסין ודגרים ב-37°C למשך 3 דקות.
   2. לאחר ניתוק מוחלט של התאים מהמנה, מוסיפים 10 מ"ל של מדיום תרבית ומעבירים את התאים עם פיפטה של 10 מ"ל לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 1,000 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את התווך, השהו מחדש את התאים ב-5 מ"ל של תווך תרבית, וספרו את התאים באמצעות מונה תאים. צלחת 2X10⁶ תאים בכל אחת משתי מנות בקוטר 10 ס"מ.
   3. אפשרו לתאים להיצמד ולהתאושש בן לילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. החל טיפול על צלחת אחת כדי לגרום להיווצרות עמילואידים עם 20 ng/mL Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α), 100 nM Smac-mimetic, ומעכב pan-caspase 20 μM Z-VAD-FMK. השילוב מקוצר כ-TSZ. התייחסו למנה השנייה עם הרכב כבקרה.
2. לאחר משך הזמן המתאים, בדרך כלל 6 שעות, לקצור את התא lysate.
   1. מגרדים את התאים מהצלחת עם מגרד פלסטיק ומשתמשים בפיפטה של 10 מ"ל כדי להעביר לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 1,000 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
   2. לשטוף את התאים 2 פעמים על ידי resuspending ב 10 מ"ל של PBS קר כקרח צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. לשאוף את פתרון PBS.
      הערה: ניתן להשהות את התהליך כאן על ידי הקפאת גלולת התא בחנקן נוזלי ואחסון ב ˗80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.
   3. מעבירים את גלולת התא לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ודגורים בחיץ ליזה של 0.3 מ"ל למשך 30 דקות על קרח. צנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C. הסופרנאטנט הוא כל התא lysate.
      הערה: ניתן להשהות את התהליך כאן על ידי אחסון הדגימה ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד מספר חודשים.
   4. מדוד את ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד. הוסף מאגר טעינה 4x SDD-AGE כדי להכין 20 μL של דגימה של 3 מיקרוגרם/μL ודגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

2. הכנה והפעלה של ג'לים

1. הוסף 2 גרם של agarose ל 200 מ"ל של 1x Tris-acetate buffer (TAE) בכוס זכוכית וחממו במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז. הוסף 1 מ"ל של 20% SDS לקבלת ריכוז סופי של 0.1% SDS. מערבלים בזהירות כדי לערבב. יש להקפיד לא ליצור בועות לאחר הוספת SDS.
2. יוצקים את תמיסת האגרוז ללוח ג'ל בגודל 15X14 ס"מ. השתמש פיפטה 1-מ"ל כדי לחסל כל בועות. מניחים מסרק אחד של 20 בארות בחלק העליון.
3. ממד ראשון: פיפטה 60 מיקרוגרם של ליזט תא שלם בנתיב הימני הקיצוני. הפעל את הג'ל ב 60 V במשך כ 4 שעות (עד שחזית הצבע היא בערך 3/4 דרך הג'ל) באמצעות TAE המכיל 0.1% SDS כחיץ הריצה.
4. ממד שני: סובבו בזהירות את הג'ל ב-90° נגד כיוון השעון (איור 1A). הפעל את הג'ל ב 60 V במשך כ 4 h.
   הערה: מצב הריצה הכללי הוא 4 V / cm ג'ל אורך. חשוב שתנאי הריצה יהיו זהים לחלוטין עבור הממד הראשון והשני.

תוצאות

איור 1. פרוטוקול ניסיוני.(A) סכמטי של אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז (2D SDD-AGE). התחל בטעינת הדגימה בנתיב הימני ביותר, המסומן באדום. לאחר סיום ריצת הממד הראשון, סובב את הג'ל 90° נגד כיוון השעון. הפעל את אלקטרופורזה הממד השני. חץ מלא מציין את כיוון ריצת הממד הראשון, חץ מנוקד מציין את כיוון ריצת הממד השני. (B) סכימת העברה על ידי פעולה נימית

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יחידת אלקטרופורזה בג'ל	פישר	HE99XPRO	Appratus עבור ריצת ג'ל.
איציק בכר	VWR	97062-250	עבור ג'ל agarose.
DMEM	סיגמא	D6429	לתרבית תאים
נסיוב בקר עוברי	סיגמא	F4135	לתרבית תאים
פניצילין-סטרפטומיצין	סיגמא	עמ' 4333	לתרבית תאים
תמיסת טריפסין	סיגמא	T4049	לתרבית תאים
PBS לתרבית רקמות	סיגמא	D8662	לתרבית תאים
TNF רקומביננטי	מיוצר במעבדה שלנו		לגרימת נקרופטוזיס. ראו הערה 11.
סמאק-מימטי	מתנה מד"ר שיאודונג וואנג		לגרימת נקרופטוזיס. ראו הערה 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	לגרימת נקרופטוזיס. ראו הערה 11.
מונה תאים	ביו-ראד	1450102	דגם TC20; לספירת תאים
ערכת בדיקת חלבון פירס™ BCA	תרמו סיינטיפיק	23225	למדידת ריכוז החלבונים בליזטים של התא
מרים תאים	פישר	07-200-364	כדי להסיר תאים מהצלחת
חיץ ליזיס (1 ליטר)			20 מ"ל 1 מטר Tris pH 7.4 10 מ"ל גליצרול<בר/> 30 מ"ל 5 מטר NaCl 840 מ"ל ddH2O 10 מ"ל Triton-X100 (מעכבי פרוטאז ופוספטים לפי הצורך)
10X TAE (1 ליטר)			48.4 גרם Tris base 11.42 מ"ל חומצה אצטית קרחונית 20 מ"ל 0.5M EDTA pH 8 ddH20 עד 1 ליטר
מאגר טעינה 4X SDD-AGE (50 מ"ל)			5 מ"ל 10X TAE 10 מ"ל גליצרול<בר/> 4 מ"ל 20% SDS 0.5 מ"ל 10% ברומופנול כחול<בר/> 31 מ"ל ddH2O
PBST חיץ כביסה (1 ליטר)			100 מ"ל 10xPBS 800 מ"ל ddH2O 1 מ"ל טווין20
10X PBS (10 ליטר)			800 גרם NaCl 20 גרם KCl 144 גרם Na2HPO4·2H2O 24 גרם KH2PO4 הוסף ddH2O ל- 10 L