Multimer-PAGE להפרדת קומפלקסים חלבוניים מקומיים: טכניקת הפרדה היברידית המורכבת מ- Blue Native-PAGE ו- SDS-PAGE להפרדת חלבונים מולטימריים שלמים מליזט רקמות

Abstract

מקור: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: שיטה ללכידה ופתרון של קומפלקסים חלבוניים בדגימות ביולוגיות. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר PAGE מולטימרי להפרדת קומפלקסים חלבוניים טבעיים מהומוגנאטים ברקמות. הטכניקה היא הכלאה של טכניקות כחולות-ילידיות-PAGE ו-SDS-PAGE. ניתן לאפיין ולחקור את המתחמים המופרדים על תפקידם בתפקוד התא.

Protocol

1. הכנת רקמות

1. הכנת 10 מ"ל של מאגר דגימה 4x BN-PAGE (200 mM Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methane (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w/v glycerol, 0.004% Ponceau S, pH 7.2).
   הערה: ניתן להכין מראש תמיסת מלאי זו ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C.
2. לדלל 250 μL של חיץ דגימה 4x ב 750 μL dH₂O המכיל 1x קוקטייל מעכב פרוטאז מסחרי. מערבולת וצינה על קרח.
3. הומוגניזציה של 20 מ"ג של רקמת מטרה במאגר הדגימה BN-PAGE קר כקרח של 1 מ"ל עם 30 פעימות של הומוגנייזר נקי.
   הערה: עבור ניסוי הדגמה זה, רקמת המטרה היא רקמת מוח שלמה של חולדה. לאחר הומוגניזציה, ניתן לטפל בדגימות עם חומר ניקוי עדין כגון 2% דיגיטונין כדי להמיס ולאפשר אלקטרופורזה של חלבוני ממברנה.
4. העבר את ההומוגנאט לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה במינון 14,000 x גרם למשך 30 דקות כדי לשחרר תוכן תאי בלתי מסיס. לאחר הצנטריפוגה, דקנו את הסופרנאטנט לצינור נקי על קרח.
5. פעל בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד את ריכוז החלבון העל-טבעי באמצעות חומצה ביכונית-כונונית (BCA) או בדיקת כימות חלבון דומה.
6. אם הדגימות ההומוגניות מכילות חומר ניקוי, יש להוסיף כמות של 5% Coomassie Blue G-250 בתמיסה מימית המספיקה כדי להביא את התמיסה ההומוגנית ל-0.25% Coomassie.

2. BN-PAGE

1. לדלל 25 מ"ל 20x כחול מקורי (BN) מלאי חיץ אלקטרופורזה (1.0 M Bis-Tris, 1.0 M tricine, pH 6.8) לתוך 475 מ"ל dH₂O המכיל 0.002% Coomassie Blue כדי ליצור 500 מ"ל של 1x חיץ ריצה.
   1. אם הדגימות מכילות חומר ניקוי, במקום זאת הכינו 250 מ"ל של חיץ ריצה אחד המכיל 0.02% קומאסי ועוד 250 מ"ל שאינו מכיל אף אחד.
2. חוצץ קירור (ים) ל 4 ° C.
3. נקו והרכיבו קסטת יציקת ג'ל פוליאקרילאמיד בהתאם להוראות היצרן.
4. יוצקים ג'ל פוליאקרילאמיד BN (3% שכבת ערימה T, 6% T שכבת פתרון) על פי מתכון סטנדרטי ומניחים את מסרק הבאר.
5. לאחר שהג'לים עברו פולימריזציה, שטפו את הקלטת עם dH₂O והרכיבו את מכשיר האלקטרופורזה בהתאם להוראות היצרן.
6. הסר את מסרק הבאר ומלא את הבארות במאגר ריצה 1x BN-PAGE. הימנעו ממילוי כל החדר הפנימי במאגר עד לטעינת הדגימות.
   1. אם הדגימות מכילות חומר ניקוי, מלא את הבארות במאגר המכיל 0.02% Coomassie Blue.
      הערה: בצע את שלבים 2.7-2.9 ב-4°C.
7. בעזרת קצוות העמסת ג'ל, פיפטה נפח של הומוגנט המכיל 20 מיקרוגרם חלבון לתוך הבארות הרצויות. פיפטה נפח שווה ערך של מאגר דגימה 1x BN-PAGE לכל בארות שאינן בשימוש.
   הערה: השתמש בריכוז החלבון שנקבע מבדיקת BCA כדי לחשב את הנפח המתאים של ההומוגנט להוסיף לבארות.
8. לאחר טעינת הדגימות, מלא את החדר הפנימי במאגר פועל 1x BN-PAGE. ודאו שהג'ל שקוע כולו בחיץ. לאחר מכן, מלא את החדר החיצוני עם 1x פועל מאגר לרמה המצוינת על ידי היצרן.
   1. אם הדגימות מכילות חומר ניקוי, מלא את התא הפנימי במאגר 1x המכיל 0.02% Coomassie Blue, ואת התא החיצוני במאגר ריצה 1x ללא צבע.
9. חבר את האלקטרודות לספק הכוח ואלקטרופורזה את החלבונים בג'ל ב 150 V עד רצועת הצבע מתקדמת ~ 2 ס"מ לתוך שכבת הפתור. עצור ונתק את ספק הכוח.

3. קישור צולב

הערה: בצע שלבים 3.1-3.6 ב- 4 °C.

1. לפרק את מנגנון האלקטרופורזה ולהפריד את זגוגיות הזכוכית של קסטת הג'ל. הסירו והשליכו את שכבת הערימה.
2. חותכים בזהירות את הג'ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית הצבע. דאגו להפוך את החיתוך הזה לחלק וישר ככל האפשר, ולאחר מכן השליכו את חתיכת הג'ל שאינה בשימוש. זה ישאיר ~ 2 ס"מ רוחב, רצועה אופקית של ג'ל polyacrylamide, אשר יכיל את כל החלבון במדגם homogenate.
3. חתוך את כל החלקים שאינם בשימוש לאורך הקצוות של רצועת הג'ל.
4. מניחים בזהירות את הרצועה במיכל מלח חוצץ פוספט (PBS) בנפח 10 מ"ל במיכל קטן, ומערבבים בעדינות על ידי אגוז במשך 30 דקות לאיזון.
5. לאחר שיווי משקל, להשליך ולהחליף את PBS עם עוד 10 מ"ל. פיפטה 500 μL של 25 mM DSP מומס בדימתיל סולפוקסיד לתוך PBS, ולהמשיך לערבב כאמור לעיל (שלב 3.4) במשך 30 דקות.
6. שפכו את פתרון ה-DSP. הוסף 10 מ"ל של 0.375 M tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), pH 8.8, המכיל 2% נתרן דודציל סולפט (SDS) כדי להרוות את DSP unreacted. ממשיכים באגוזים במשך 15 דקות.

4. SDS-PAGE

1. בזמן שרצועת הג'ל מרווה, הכינו פתרונות ג'ל SDS-PAGE בשיטות סטנדרטיות. אין להוסיף ריאגנטים פילמור.
2. לאחר המרווה מחזירים את רצועת הג'ל ΒΝ לטמפרטורת החדר, ויוצקים את הרצועה לקסטת ג'ל חדשה.
   1. כדי לעשות זאת, בזהירות להרים את הג'ל ומניחים אותו על צלחת ספייסר קלטת ג'ל נקייה.
   2. כיוון הרצועה כך שהחלק התחתון של חזית הצבע יהיה הקרוב ביותר לחלק העליון של קסטה חדשה (כלומר, הצד שנסע הכי רחוק במהלך BN-PAGE צריך להיות הקרוב ביותר לחלק העליון של הקלטת החדשה; יש להפוך את רצועת הג'ל מהכיוון הקודם שלה). ראו איור 1.
   3. מקמו את הרצועה כך שהקצה העליון שלה יהיה אחיד עם המקום שבו יהיה הקצה העליון של צלחת הכיסוי (כלומר, הוא יהיה בחלק העליון של הג'ל החדש). ודאו שחזית הצבע מקבילה לקצוות האופקיים של לוח הזכוכית.
   4. דחפו צד אחד של הרצועה שנכרתה כנגד אחד מדפנות הספייסר, והשאירו מקום בצד השני למזיגת הג'ל ולהעמסה של תקן חלבון או סולם.
   5. אם הקצה התחתון של רצועת הג'ל מכיל אזורים משוננים או לא אחידים, חתכו אותם בזהירות. אם הם קיימים, הם ילכדו בועות במהלך מזיגת הג'ל.
   6. לאחר מיקום נכון של רצועת הג'ל, הניחו את צלחת הכיסוי מעל צלחת הספייסר. הפעילו לחץ עדין כדי לדחוף החוצה בועות אוויר כלואות.
   7. המשך להרכיב את מנגנון יציקת הג'ל בהתאם להוראות היצרן.
3. מוסיפים ריאגנטים פילמור למאגר הג'ל המפענח, ויוצקים אותו לקסטת הג'ל המוכנה, באמצעות פיפטה סרולוגית. ממלאים את קסטת הג'ל עד ~2 ס"מ מתחת לרצועת הג'ל BN-PAGE שנכרתה, כדי להשאיר מקום לשכבת הערימה.
4. מוסיפים 100 μL בוטנול מעל החלק העליון של הג'ל שנמזג ומאפשרים 30 דקות לפילמור של שכבת הפתרון. יוצקים את הבוטנול.
5. הוסף ריאגנטים פילמור לתמיסת ג'ל הערימה. בעזרת פיפטה סרולוגית, יוצקים את שכבת הערימה כדי למלא את כל החלל הריק שנותר בקלטת הג'ל.
   1. הטו את קסטת הג'ל בזמן ששכבת הערימה נמזגת כך שהיא תמלא את החלל שמתחת לרצועת הג'ל, ובועות האוויר לא יילכדו.
   2. כאשר חיץ הג'ל הנערם ממלא את החלל הריק מתחת לרצועת הג'ל, החזירו בהדרגה את קסטת הג'ל לבסיס ישר.
   3. המשיכו למלא את החלל הריק שליד רצועת הג'ל שנכרתה במאגר הג'ל הנערם, עד שהוא כמעט עולה על גדותיו.
6. מאפשרים לשכבת הערימה להתפלמר למשך 30 דקות.
   הערה: צור מאגר ריצה של 10x SDS-PAGE (250 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane (tris), 1.9 M glycine, 1% SDS) בזמן שהג'ל מתפלמר. זה יכול להיעשות גם מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר.
7. דלל מלאי מאגר פועל של 50 מ"ל 10x SDS-PAGE ל- 450 מ"ל dH₂O כדי ליצור מאגר עבודה אחד.
8. לאחר ששכבת הערימה עברה פולימריזציה, הסירו את קסטת הג'ל ממנגנון המזיגה, שטפו עם dH₂O והרכיבו את מכשיר האלקטרופורזה בהתאם להוראות היצרן.
9. מלא את התא הפנימי לחלוטין עם מאגר פועל 1x SDS-PAGE, ולאחר מכן מלא את התא החיצוני לרמה שצוינה על-ידי היצרן.
10. יש להעמיס את החלל שליד רצועת הג'ל שנכרתה בסולם משקל מולקולרי או בתקן חלבון מתאים.
11. חבר את האלקטרודות לספק הכוח, ואלקטרופורזה את הדגימות ב 120 V. כאשר צבע קומאסי נגמר מהג'ל, עצור ונתק את ספק הכוח.
12. לנתח את הג'ל באמצעות שיטות סטנדרטיות של electroblotting וזיהוי חלבון על ידי קשירת נוגדנים.

Results

איור 1: תרשים זרימה כללי של multimer-PAGES.
(A) הכן ליזט רקמה בשיטות שאינן דנטורציה, כגון הומוגניזציה במאגר דגימות BN-PAGE. (B) פיפטה ליזט לתוך ג'ל BN-PAGE, ולאחר מכן לבצע אלקטרופורזה (150 וולט) במאגר פועל BN-PAGE. יש לאפשר לדגימה לנדוד עד שחזית הצבע נודדת ~2 ס"מ לתוך ג'ל הפתרון. (C) הסירו את שכבת הערימה ואת החלק שאינו בשימוש של שכבת הפתרון. (D) יש ל...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
כימיקלים
חומצה ε-אמינוקפרואית	סיגמא	A2504
אקרילאמיד	אקרוס אורגניקס	164855000	רעיל.
אקרילאמיד/ביסקרילאמיד 37.5:1 (תמיסת מלאי 40% טון)	BioRad	161-0148	רעיל.
אמוניום פרסולפט	סיגמא	A3678
נגד ארנב IgG-HRP מעז	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	SC-2004
ערכת בדיקת חומצה ביצינכונינית	תרמופישר	23225
ביס-טריס	סיגמא	B9754
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A9647
בוטאנול	פישר סיינטיפיק	A399-1
ערכת מצע Chemiluminescence	תרמופישר	24078
קומאסי כחול G-250	סיגמא-אולדריץ'	B0770
דיגיטונין	סיגמא	D141	רעיל.
דימתיל סולפוקסיד	פישר סיינטיפיק	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	תרמו סיינטיפיק	22585
חלב יבש ללא שומן	מעבדה סיינטיפיק	M0841
גליצרול	סיגמא	G9012
גליצין	פישר סיינטיפיק	BP381-5
קוקטייל מעכב פרוטאז עצור	תרמופישר	78430
חומצה הידרוכלורית	פישר סיינטיפיק	A144SI-212	לטיטרציה. קאוסטי.
מתנול	פישר סיינטיפיק	A412-4	להפעלת קרום PVDF. רעיל.
חד-שבטי אנטי α-סינוקלאין IgG מארנב	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	סיגמא	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	אקרוס אורגניקס	16479	רעיל.
NP40	בוסטון ביופרודקטס	P-872
פוליסורבט 20 (טווין-20)	פישר סיינטיפיק	BP337-500
ממברנות העברת פלואוריד פוליווינילידן	תרמו סיינטיפיק	88518
פונסאו ס	סיגמא	P3504
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	עמ' 217-3
אשלגן פוספט מונובייסיק	סיגמא	עמ' 9791
קוקטייל מעכב פרוטאז	תרמו סיינטיפיק	88265
פתרון SDS (10% עם v)	BioRad	161-0416
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	BP358-212
סודיום דודציל סולפט	סיגמא	L37771
נתרן פוספט מונובייסיק	פישר סיינטיפיק	BP329-1
טריצין	סיגמא	T0377
בסיס טריס	פישר סיינטיפיק	BP152-500
Tris-HCl (מאגר של 0.5 M, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (חיץ של 1.5 M, pH 8.8)	BioRad	161-0798
מכשירים
GE Imagequant LAS 4000	GE שירותי בריאות	28-9558-10
תוכנת ImageJ NIH
קורא מיקרו-צלחות Synergy H1	ביוטק
ג'ל לשעבר + מעמד	ביוראד
מיקרופוגה 22R צנטריפוגה	בקמן קולטר
2 מ"ל להקפיץ homogenizer
מערבל מערבולות	פישר סיינטיפיק
הומוגנייזר רקמות קולי	פישר סיינטיפיק	FB120220