אלקטרופורזה של ג'ל Agarose של אמפליקונים DNA פוסט PCR: שיטה לנתח מוצרים של PCR מולטיפלקס ולהעריך הצלחה בתגובת PCR

תקציר

מקור: Gulla, S. et al. Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים את ההפרדה של DNA מוגבר PCR חיידקי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. ג'ל אגרוז מתפקד כמסננת מולקולרית, ומאפשר לדנ"א הטעון שלילית לנדוד בהתאם לגודלו תחת שדה חשמלי מופעל.

פרוטוקול

1. אישור אמפליקון PCR על ידי אלקטרופורזה בג'ל

1. על פי המלצות היצרן, הכינו נפח של 1.5% (w/v) ג'ל אגרוז בחיץ 1x tris-borate-EDTA (TBE) המתאים למספר תגובות ה-PCR שיש לבדוק. לפני היציקה, להוסיף 5 μL של צבע חומצת גרעין פלואורסצנטית לכל 50 μL של תמיסת ג'ל ולערבב. השתמשו במגשים ובמסרקים בהתאם ליציקה, והשאירו מספר מתאים של בארות פנויות לסולמות ייחוס DNA.
2. לאחר ההגדרה, יש לטבול את הג'ל ב-1x TBE-buffer במערכת GE. מערבבים 5 μL של מוצר PCR יחד עם 2 μL של צבע טעינה ולהעביר בארות ג'ל. הוסף 5 μL של סולם DNA בבארות ריקות לעיון.
3. הפעל את הג'ל ב 110 V לכל 15 ס"מ במשך כשעה אחת והשתמש במערכת הדמיה/הדמיה של ג'ל מבוססת UV כדי לאמת את נוכחותם של רצועות מרובות (עד חמש) המייצגות אמפליקונים PCR (ראה דוגמה באיור 1). יש להשליך את הג'ל. אחסנו את מוצרי ה-PCR הנותרים בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד נוסף.

תוצאות

איור 1: אלקטרופורזה בג'ל המאמתת את נוכחותם של מוצרי PCR מרובים. התמונה מאשרת את נוכחותם של אמפליקונים PCR מרובים בכל 12 הנתיבים המכילים דגימות, כאשר הנתיב הראשון מייצג את סולם ה- DNA בו נעשה שימוש. צוינו הגדלים של שברי סולם נבחרים, כמו גם בדיקת ה-PCR ושיוך המאמץ של כל נתיב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agarose, אוניברסלי, peqGOLD	VWR	732-2789פ/732-2788
מאגר Tris-borate-EDTA (TBE)	נה	נה	מתכון סטנדרטי; מיוצר בבית.
צבע לטעינת ג'ל DNA (6X)	תרמו פישר סיינטיפיק	₪0611
מערכת אלקטרופורזה בג'ל	כמועדף	נה
ג'ל Red Nucleic Acid Stain, 10,000X במים	ביוטיום	41003	צבע חומצת גרעין פלואורסצנטית
GeneRuler 50 bp סולם DNA, מוכן לשימוש	תרמו פישר סיינטיפיק	SM0373	סולם DNA
מערכת הדמיה/הדמיה של ג'ל מבוססת UV	כמועדף	נה