אלקטרופורזה נימית: טכניקה לניתוח אמפליקונים של תגובת שרשרת פולימראז המסומנים באופן פלואורסצנטי

תקציר

מקור: Gulla, S. et al., Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של אלקטרופורזה נימית לניתוח אמפליקונים PCR מסומנים פלואורסצנטית המתקבלים מדגימות שונות בהתבסס על גודלן. הוא יוצר תבנית נודדת הקובעת את אורכי זוג הבסיס של השברים בעזרת הצבע הפלואורסצנטי המסומן בכל שבר.

פרוטוקול

1. מצב התקנה והפעלה של אלקטרופורזה נימית

1. לאחר אישור מגברי PCR, יש לדלל מוצרי PCR ביחס 1:10 (v/v) במים מטוהרים. אוטמים, מערבבים וצנטריפוגות לזמן קצר.
2. עבודה בארון נדפים, להכין נפח של תערובת מאסטר המורכב 9 μL של פורממיד ו 0.5 μL של גודל סטנדרטי לכל מוצר PCR (לאפשר 10% נפח עודף). מערבלים לזמן קצר ומפיצים 9.5 μL לבארות על צלחת המתאימה למערכת CE הזמינה לפני הוספת 0.5 μL של מוצר PCR מדולל. אוטם, מערבב וצנטריפוגה לזמן קצר.
   אזהרה: יש לטפל בזהירות. ערבוב פורממיד עם מים יוצר חומצה פורמית, שהיא רעילה.
3. באמצעות מחזור תרמי PCR, denature הדגימות ב 95 ° C במשך 3 דקות לפני קירור ל 4 ° C ללא הגבלת זמן. צנטריפוגה לזמן קצר ולהעמיס את הצלחת על מערכת CE מכויילת בהתאם להוראות היצרן.
4. הפעל ניתוח שברים CE באמצעות ריאגנטים בהתאם למנגנון הבחירה ולהגדרות הבאות: 60 ° C; 5 שניות זריקות ב- 1.6 kV (32 V לס"מ); זמן פעולה של 32 דקות ב- 15 kV (300 V לס"מ). ניתוח שברי CE של 24 בארות על 24 נימים (50 ס"מ) ייקח בדרך כלל כ -50 דקות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Avant 3500xL מנתח גנטי	תרמו פישר סיינטיפיק	A30469	משמש לניתוח שבר אלקטרופורזה נימית.
ג'ל Red Nucleic Acid Stain, 10,000X במים	ביוטיום	41003	צבע חומצת גרעין פלואורסצנטית המשמש במהלך אלקטרופורזה ג'ל.
תוכנת GeneMapper 5	תרמו פישר סיינטיפיק	4475073	משמש לקריאת אלקטרופרוגרמות מאלקטרופורזה נימית.
GeneScan 600 צבע LIZ גודל סטנדרטי v2.0	תרמו פישר סיינטיפיק	4408399	תקן גודל המשמש במהלך אלקטרופורזה נימית.
Hi-Di Formamide	תרמו פישר סיינטיפיק	4311320/4440753	פורממיד דה-יוניזציה המשמש במהלך אלקטרופורזה נימית. הכינו משקאות חריפים לעבודה.
מילי-קיו מים	נה	נה	מים מטוהרים המשמשים במהלך PCR ואלקטרופורזה נימית. מתכון סטנדרטי; מיוצר בבית.
פולימר POP-7 עבור אנלייזרים גנטיים 3500 Dx/3500xL Dx	תרמו פישר סיינטיפיק	A26077/4393713/4393709	מטריצת הפרדה המשמשת במהלך אלקטרופורזה נימית.
מערכת הדמיה/הדמיה של ג'ל מבוססת UV	כרצונך.	נה
וורטקסר	כרצונך.	נה