אלקטרופורזה ג'ל אלקליין חד-תאי: טכניקה רגישה להערכה כמותית של נזק לדנ"א בתאי סרטן בודדים לאחר כימותרפיה

תקציר

מקור: Lu, Y., et al. Evaluating In Vitro DNA Damage using Comet Assay J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת אלקטרופורזה חד-תאית בסיסית כדי לכמת הפסקות דנ"א חד-גדילי ודו-גדילי בתאים שטופלו בדוקסורוביצין. תנאים בסיסיים משבשים את קשרי המימן בין זוגות בסיסי דנ"א, וכתוצאה מכך מתרופפים ונפרדים לחלוטין גדילי הדנ"א. זה מאפשר נדידה דיפרנציאלית של מקטעי DNA לא פגומים ופגועים בג'ל אגרוז על אלקטרופורזה, חושף מבנה בצורת שביט של דנ"א נודד לאט שלא ניזוק ויוצר את ראש השביט המעגלי, ונדידה מהירה של מקטעי DNA פגומים היוצרים את זנב השביט המוארך.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים

1. 1x PBS
   1. לדלל 100 מ"ל 10x PBS עם 900 מ"ל dH₂O ולהתאים את ה- pH ל 7.4 באמצעות מד pH. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
2. תמיסת ליזיס (LS)
   1. הכן 2.5 M NaCl, 100 mM דיסודיום EDTA, 10 mM בסיס Tris, ו 200 mM NaOH ב 900 מ"ל dH₂O; זה בדרך כלל לוקח בערך 20 דקות כדי לאפשר את התערובת להתמוסס לחלוטין. כוונן את ה- pH ל- 10 באמצעות מד pH. הוסף 1% נתרן lauryl sarcosinate ו 1% Triton X-100 ולהתאים את נפח הסופי ל 1,000 מ"ל. מצננים ל-4°C לפחות 30 דקות לפני השימוש.
3. תמיסת אלקטרופורזה אלקליין (AES), pH >13
   1. הכינו 200 mM NaOH ו-1 mM דיסודיום EDTA ב-800 מ"ל dH₂O. התאימו את ה-pH וודאו שהוא pH >13. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 1,000 מ"ל. יש להכין טרי לפני השימוש ולצנן ל-4°C לפחות 30 דקות לפני השימוש
4. פתרון צביעה
   1. 1. הוסף 1 μL 10,000x כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית ירוקה (למשל, SYBR Green) במאגר Tris-EDTA של 30 מ"ל (10 mM Tris-HCl, 1 mM דיסודיום EDTA, pH 7.4) ואחסן ב-4°C. יש להגן מפני אור.
5. אגרוז נמס נמוך 1%
   1. יש להמיס אגרוז בנקודת התכה נמוכה של 1% (1 גרם ב-100 מ"ל dH₂O) במיקרוגל. מערבלים את האגרוז כל 15-20 שניות כדי לוודא שהאגרוז מותך לחלוטין. הכניסו את האגרוז לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני השימוש.
6. טיפים פיפטה מראש חם
   1. יש לחתוך את הקצוות הצרים של קצות פיפטה P200 ב-3 מ"מ ולחמם בטמפרטורה של 37°C לפני שפוגעים באגרוז.

2. הכנת שקופיות שביט

1. ציפוי שקופיות
   1. ממיסים 1% אגרוז (1 גרם ב-100 מ"ל dH₂O) במיקרוגל למשך 2-3 דקות או עד שהאגרוז מותך לחלוטין. טבלו את מיקרוסקופ הזכוכית לתוך האגרוז ונגבו צד אחד של המגלשה באמצעות מגבון ללא מוך.
   2. הניחו את המגלשות על משטח ישר לייבוש באוויר או לחמם בטמפרטורה של 50°C לייבוש מהיר יותר; יש ליצור סרט אגרוז שקוף לאחר הייבוש. הניחו את המגלשות המצופות בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
2. הכנת מתלים של תא בודד
   1. תרבית וטיפול בתא הגליומה
      1. תרבית את תאי U251 MG במדיום DMEM-Ham F-12 בתוספת 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-37°C עם 5% CO₂.
      2. לעכל את התאים באמצעות 1 מ"ל טריפסין במשך 3 דקות ולנטרל טריפסין באמצעות DMEM-Ham F-12 בינוני עם FBS. לאסוף בצינור 15 מ"ל, להסתובב ב 300 x גרם במשך 4 דקות, לשאוף את המדיום, ולהשהות תאים ב 2 x 10⁵ תאים / מ"ל ב 1x PBS.
         הערה: יש להכין את דגימת התא מיד לפני תחילת הבדיקה וכל הדגימות צריכות להיות מטופלות בסביבה חשוכה או מעומעמת כדי למנוע נזק לדנ"א מאור.
      3. ערבבו את מתלה התא עם אגרוז מותך 1% בנקודת התכה נמוכה (ב-37°C) ביחס של 1:10 (v/v), ערבבו בעדינות על ידי פיפטוף מעלה ומטה, ומיד פיפטה 30 μL על מגלשה מצופה אגרוז. השתמש בצד של קצה פיפטה כדי לפזר את תערובת האגרוז / תאים כדי להבטיח היווצרות של שכבה דקה.
      4. הניחו את המגלשה שטוחה בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך 10 דקות. הארכת זמן הג'לינג ל-30 דקות משפרת את היצמדות הדגימות בסביבות לחות גבוהה.
      5. יש לטבול את המגלשה ב-4°C LS בחושך למשך שעה עד לילה.
3. אלקטרופורזה של תא בודד
   1. לבדיקת שביט אלקליין
      1. הסירו בעדינות את המחליקים מה-LS, רוקנו את עודפי החיץ וטבלו בעדינות ב-AES למשך שעה אחת ב-4°C כדי לאפשר לדנ"א להשתחרר. השאר את המגלשות בחושך.
      2. הוסף AES מקורר מראש במגש שקופיות אלקטרופורזה, לא יעלה על 0.5 ס"מ מעל שקופיות (זה תלוי בגודל של יחידות אלקטרופורזה), מניחים את המגלשות בפנים לכסות עם מכסה. הגדר את מתח ספק הכוח ל- 1 V/cm (האורך בין האלקטרודות) והפעל במשך 30 דקות ב- 4°C.
      3. יש לנקז את תמיסת האלקטרופורזה העודפת מהמגלשה. יש לטבול בעדינות את המגלשות פעמיים ב-dH₂O למשך 5 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר.
      4. יש לטבול בעדינות את המגלשות באתנול 70% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. המשך להכתמה.
4. מגלשות שביט כתם
   1. יש לייבש את המגלשות בטמפרטורה של 37°C למשך 10 עד 15 דקות בחושך.
   2. יש להניח 50 - 100 μL תמיסת צביעת חומצת גרעין פלואורסצנטית ירוקה על כל אגרוז מיובש וכתם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
   3. יש לשטוף את המגלשות לזמן קצר ב-dH₂O ולייבש לחלוטין בטמפרטורה של 37°C בחושך. המשך לרכישת תמונה וניתוח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10x PBS (Ca++, Mg++ חינם)	TEKnova	P0196
NaCl	סיגמא	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
בסיס טריזמה	סיגמא	T1503
נאוה	סיגמא	72068
נתרן לאוריל סרקוזינט	סיגמא	L7414
טריטון X-100	סיגמא	93443
SYBR ירוק	Invitrogen	S33102
נקודת התכה נמוכה agarose	Invitrogen	16520
אגרוז	Invitrogen	16500
95% אתנול	וורנר-גרהאם	#64-17-5
טריפסין	גיבקו	25300-054
שקופיות רקמת זכוכית	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	63422-11
מגבונים	קימברלי-קלארק
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות	דנוויל
טיפים לפיפטה	חד
מיקרוגל	אוונטי
אמבט מים	דיוק
תא אלקטרופורזה אופקי	טרוויגן	Cometassay ES II
ספק כוח	ביו-ראד
אינקובטור	קווינסי לאב	דגם 12-140E
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	זיס	LSM700
מיקרופיפטור	אפנדורף