אלקטרופורזה נימית מיקרופלואידית לגודל מקטעים של מוצרי PCR: טכניקת הפרדה אלקטרופורטית מבוססת שבב להפרדת מקטעי DNA על בסיס גודל

תקציר

מקור: Wang, H., Zhu et al. A Robust Polymerase Chain Reaction-Based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את טכניקת האלקטרופורזה הקפילרית המיקרופלואידית להפרדת אמפליקונים PCR בהתבסס על גודלם. טכניקה זו מסייעת בגודל השבר באמצעות צבעים פלואורסצנטיים וסמני גודל מולקולריים סטנדרטיים.

פרוטוקול

1. גודל מקטע של מוצרי PCR

1. לפני שמתחילים, אפשרו לרכז צבע DNA, מטריצת ג'ל DNA, סמן DNA, סולם DNA ודגימות DNA מטוהרות להתאזן לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
2. הגדרת תחנת ההכנה
   1. החלף את המזרק (ראה טבלת חומרים) בעת שימוש באצווה חדשה של ריאגנטים.
   2. כוונן את צלחת הבסיס, שחרר את הידית של תפס המזרק והחלק אותו כלפי מעלה למיקום העליון.
3. הפעל את תוכנת המידות (ראה טבלת חומרים) והכן את תערובת צבע הג'ל.
4. צבע מערבולת להתרכז במשך 10 שניות ולסובב כלפי מטה. מוסיפים 25 μL של הצבע לבקבוקון מטריצת ג'ל. מערבלים היטב את התמיסה המעורבת ומסתובבים למטה.
   1. מעבירים את תערובת צבע הג'ל למסנן סיבוב. הניחו את מסנן הסחיטה במיקרו-צנטריפוגה וסחררו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בטמפרטורה של 1,500 x גרם ± 20%.
      הערה: יש להגן על התמיסה עם צבע מאור ולאחסן בטמפרטורה של 4°C לאחר השימוש. ניתן להשתמש בתערובת צבע הג'ל לכ-15 שבבים לאחר הכנתה. הניחו לתערובת צבעי הג'ל להתאזן לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בכל פעם לפני השימוש.
5. העמיסו את תערובת צבעי הג'ל
   1. הכנס שבב DNA חדש לתחנת הפריימינג. הוסף 9 μL של תערובת צבע ג'ל לתוך מסומן היטב עם "G". אנא ודא שהבוכנה ממוקמת בסימן 1 מ"ל ולאחר מכן סגור את תחנת הפריימינג.
   2. לחץ על בוכנת המזרק כלפי מטה עד שהיא מוחזקת על ידי האטב. המתן בדיוק 30 שניות ואז שחרר את הקליפ. המתן 5 שניות, ולאחר מכן לאט לאט למשוך את הבוכנה בחזרה למצב 1 מ"ל.
   3. פתח את תחנת הפריימינג והוסף 9 μL של תערובת צבע ג'ל לתוך הבארות המסומנות ב- "G".
6. הוסף 5 μL של סמן לתוך הבאר המסומנת בסמל הסולם וגם להוסיף 5 μL של סמן לכל אחת מ -12 בארות הדגימה. אל תשאירו בארות ריקות.
7. הוסף 1 μL של סולם DNA לתוך הבאר מסומן עם סמל הסולם. הוסף 1 μL של מוצר PCR (בארות משומשות) או 1 μL של מים טהורים במיוחד (בארות שאינן בשימוש) לכל אחת מ -12 בארות הדגימה. שים את השבב אופקית במתאם של מערבל מערבולת מערבולת במשך 1 דקה בהגדרה המצוינת (2,400 סל"ד).
8. הכנס את השבב למכשיר הביואנלייזר והפעל את השבב במכשיר תוך 5 דקות.
9. לאחר השלמת הבדיקה, הסר מיד את השבב המשומש מהמכשיר.
10. הוסף לאט 350 μL של מים deionized לתוך אחת הבארות של מנקה אלקטרודות. פתח את מכסה הביואנלייזר והנח לתוכו את מנקה האלקטרודות. סוגרים את המכסה ודגרים כ-10 שניות. פתח את המכסה והסר את מנקה האלקטרודות. המתן עוד 10 שניות כדי לאפשר למים על האלקטרודות להתאדות ולאחר מכן סגור את המכסה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכשיר ביואנלייזר Agilent 2100: צינורות PCR 0.2 מ"ל	אקסיגן	PCR-02D-C
מכשיר ביואנלייזר Agilent 2100: 1x TE buffer, pH 8.0, ללא Rnase	אמביון	AM9849
מכשיר ביואנלייזר Agilent 2100: מכשיר ביואנלייזר 2100	אג'ילנט	G2939AA
מכשיר ביואנלייזר Agilent 2100: צלחת PCR 96 באר	תרמו פישר	AB0800
מכשיר ביואנלייזר Agilent 2100: מחסנית אלקטרודה	אג'ילנט		מספק ציוד של מכשיר Bioanalyzer 2100
מכשיר ביואנלייזר Agilent 2100: מערבל מערבולות IKA	אג'ילנט		מספק ציוד של מכשיר Bioanalyzer 2100
מכשיר ביואנלייזר Agilent 2100: תוכנת מידות 2100 תוכנת מומחה	אג'ילנט		מספק ציוד של מכשיר Bioanalyzer 2100
מכשיר Agilent 2100 Bioanalyzer: שבבי בדיקה	אג'ילנט		מספק ציוד של מכשיר Bioanalyzer 2100
ערכת Agilent DNA 7500	אג'ילנט	5067-1506	עבור גודל מקטע
ערכת DNA 7500 Agilent: סולם DNA 7500 (כובע צהוב)	אג'ילנט		בערכה: ערכת Agilent DNA 7500 (מק"ט: 5067-1506)
ערכת DNA 7500 Agilent: DNA 7500 Markers (כובע ירוק)	אג'ילנט		בערכה: ערכת Agilent DNA 7500 (מק"ט: 5067-1506)
ערכת Agilent DNA 7500: שבבי DNA	אג'ילנט		בערכה: ערכת Agilent DNA 7500 (מק"ט: 5067-1506)
ערכת Agilent DNA 7500: תרכיז צבע DNA (כובע כחול)	אג'ילנט		בערכה: ערכת Agilent DNA 7500 (מק"ט: 5067-1506)
ערכת DNA 7500 Agilent: בקבוקון DNA Gel Matrix (כיפה אדומה)	אג'ילנט		בערכה: ערכת Agilent DNA 7500 (מק"ט: 5067-1506)
ערכת Agilent DNA 7500: מנקה אלקטרודות	אג'ילנט		בערכה: ערכת Agilent DNA 7500 (מק"ט: 5067-1506)
ערכת Agilent DNA 7500: מסנן ספין	אג'ילנט		אספקה של ערכת Agilent DNA 7500 (מק"ט: 5067-1506)
ערכת Agilent DNA 7500: מזרק	אג'ילנט		אספקה של ערכת Agilent DNA 7500 (מק"ט: 5067-1506)
תחנת פרימינג צ'יפ	אג'ילנט	5065-4401	מספק ציוד של מכשיר Bioanalyzer 2100
סעפת ואקום צלחת פילטר: סעפת ואקום MultiScreenHTS	מרק מיליפור	MSVMHTS00	מכשיר ואקום לסעפת ואקום צלחת סינון לטיהור מוצר PCR
שואב אבק צלחת מסנן סעפת: פקק סיליקון	מרק מיליפור	XX2004718	מסנן צלחת ואקום סעפת
שואב אבק צלחת מסנן סעפת: משאבת ואקום	מרק מיליפור	WP6122050	מסנן צלחת ואקום סעפת
שואב אבק צלחת מסנן סעפת: כלי איסוף פסולת	מרק מיליפור	XX1004705	מסנן צלחת ואקום סעפת