דף SDS ללא חיזור: שיטה לניתוח קומפלקסים של חלבון מולטימרי המקושר לדיסולפיד

תקציר

מקור: Rotoli, S. M. et al., שילוב ניתוח SDS-PAGE ללא הפחתה וקרוסלינקינג כימי לאיתור קומפלקסים מולטימריים המיוצבים על ידי קשרים דיסולפידים בתאי יונקים בתרבית. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הפרדת דגימות החלבון על ידי SDS-PAGE שאינו מפחית כדי לנתח את קומפלקסי החלבונים הרב-תכליתיים. טכניקה זו שומרת על תת-היחידות המרובות של חלבון המוחזק על ידי הקשרים הדיסולפידים, אשר מאוחר יותר ניתן לנתח על ידי כתם מערבי.

פרוטוקול

1. חסימת שאריות ציסטאין חופשי באמצעות יודואצטמיד

1. יש לגדל תאי מערכת הפעלה U-2 בצלחת^בגודל 6 ס"מ עד למפגש של 50%-60% בתווך חיוני מינימלי עם גלוקוז גבוה המכיל 10% נסיוב בקר עוברי ונתרן פירובט 1% ב-37°C ב-5%_CO2.
2. הכינו מלאי טרי של 10 mM iodoacetamide ממש לפני השימוש, ולאחר מכן השליכו כל מגיב שאינו בשימוש.
3. הוסף יודואצטמיד בריכוז סופי של 0.1 mM ישירות למדיית תרבית התא. נענעו בעדינות את המנה בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.

2. קצירת התאים

1. שאפו את המדיה מהתאים.
2. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של מלוחים פוספט קר חוצץ (PBS) שלוש פעמים. שאפו את תמיסת השטיפה הסופית של PBS ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר.
3. מגרדים את התאים מתחתית הצלחת באמצעות מגרד תאים. באמצעות פיפטה 1 מ"ל לצייר את PBS ואת תרחיף התא ולחלק את כל הנוזל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
4. סובב את התאים ב 7,500 x גרם במשך שלוש דקות ב 4 ° C. לשאוף את PBS, להשאיר את גלולת התא מאחור. ניתן לאחסן את גלולת התא ב -80 °C עד לעיבוד

3. מיצוי חלבון

1. הכינו 100 μL של חיץ ליזיס 1x מדולל ב-ddH₂O (ראו טבלת חומרים). יש להוסיף פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) מיד לפני השימוש לריכוז סופי של 1 מילימול.
2. הוסף 50 μL של חיץ ליזיס 1x ישירות לגלולה התא ולהשהות. דוגרים על קרח במשך 5 דקות.
3. סוניק במשך 8 שניות באמצעות מצב פולס קבוע של 40% (ראה טבלת חומרים עבור סוניקטור; כוונן לפי הצורך עבור סוניקטורים שונים), תוך שמירה על התמצית על קרח.
4. סבבו את התמצית בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות במהירות של 16,000 x גרם. הסופרנאטנט הוא מקטע החלבון המסיס. ניתוח ברדפורד יכול להתבצע כדי לקבוע את ריכוז החלבון במידת הצורך.

4. הכנת דוגמאות

1. יש ליטול 10 μL של תמצית חלבון מסיס ולהוסיף 10 μL של מאגר דגימת SDS 1x Laemmli (4% SDS, 20% גליצרול, 0.004% ברומופנול כחול ו-0.125 M Tris-HCl, pH 6.8). אין להוסיף ריאגנטים מחזרים.
2. שמור דגימות על קרח אם ניתוח SDS PAGE יבוצע באותו יום; לאחסון לטווח ארוך, -20 ° C מתאים. ממש לפני הפעלת הג'ל, חממו את הדגימה במשך 5 דקות בטמפרטורה של 85°C.

5. In Vivo פורמלדהיד הצלבה של חלבונים אנדוגניים בתאי מערכת ההפעלה U-2

1. לגדל תאי מערכת הפעלה U-2 בבקבוק² של 175 ס"מ למפגש של 70%-80%.
2. ביצוע תגובת הצלבה של פורמלדהיד
   1. במכסה אדים, aliquot תמיסת פורמלדהיד 37% שנרכשה ממקורות מסחריים. מוסיפים את חומר קיבוע הפורמלדהיד ישירות למדיום לריכוז סופי של 1% ודוגרים בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה במשך 15 דקות.
   2. כדי להרוות את התגובה, יש להוסיף גליצין באורך 1.25 מ' לריכוז סופי של 0.125 מ' ולדגור בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה על נדנדה למשך 5 דקות.
3. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS קר שלוש פעמים. שאפו את תמיסת השטיפה הסופית של PBS והוסיפו 10 מ"ל PBS. מגרדים את התאים מתחתית הבקבוק באמצעות מגרד תאים.
4. באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, צייר את PBS ואת תרחיף התא ושחרר את כל הנוזל לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. סובב את התאים ב 500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. לשאוף את PBS, משאיר את גלולת התא מאחור.

6. שבר גרעינים

1. הכן 10 מ"ל של מאגר הומוגניזציה: 0.25 M סוכרוז, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, ו 0.5% BSA ב pH 7.4. יש להוסיף PMSF מיד לפני השימוש לריכוז סופי של 1 מילימטר ו-3 מ"ל של חיץ תרחיף גרעינים (0.1% Triton X-100 ב-PBS).
2. הוסף חיץ הומוגניזציה של 5 מ"ל ישירות לגלולת התא והשהה לחלוטין. צנטריפוגה את המתלים ב 500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן להשליך את supernatant.
3. להשעות את הגלולה ב 5 מ"ל של חיץ הומוגניזציה. השתמש הומוגנייזר זכוכית טפלון הדוק, הומוגניזציה התאים ב 10 פעימות / 500 סל"ד.
4. צנטריפוגה את המתלים ב 1,500 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
   הערה: השתמש בסופרנאטנט לבידוד מיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 10 דקות.
5. יש להשהות את הגלולה בחיץ תרחיף גרעיני 1 מ"ל ולדגור על קרח למשך 10 דקות.
6. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 10 דקות. להשליך את supernatant.
7. להשהות את הגלולה ב 1 מ"ל גרעיני חיץ צנטריפוגה וצנטריפוגה שוב. השליכו את הסופרנטנט. הגלולה הסופית תהיה גרעינים מבודדים.

7. מיצוי חלבון

1. חזור על סעיף 4, למעט הוספת 25 μL של חיץ הליזיס 1x ישירות לגלולת התא ואז השהיה.

8. הכנת דוגמאות

1. הכינו שתי דוגמאות עבור SDS-PAGE על ידי לקיחת 10 μL כל אחת מתמצית החלבון המסיס והוסיפו 10 μL של 2x Laemmli SDS-sample buffer ו-1 μL של 2-Mercaptoethanol (BME).
2. חממו דגימה אחת במשך 5 דקות ב-37°C ואת הדגימה השנייה במשך 15 דקות ב-98°C כדי להפוך את הקישור הצולב של פורמלדהיד.

9. ניתוח SDS-PAGE

1. הכן 1 ליטר של מאגר ריצה 1x Tris-glycine (25 mM Tris, 192 mM גליצין, 0.1% (w/v) SDS).
2. הגדרת מנגנון ההפעלה SDS-PAGE.
   הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-TGX SDS-Page טרומי של 16%. שימו לב, ניתן להשתמש בכל אחוז ג'ל.
   1. בהתאם לפרוטוקול היצרן, פתח את החבילה בה מאוחסן הג'ל והסר את הקלטת.
   2. הסר את המסרק המרפד את הבארות ואת הסרט מתחתית הקלטת.
   3. הכניסו את הג'ל למנגנון הריצה.
   4. מלאו את התא בחיץ ריצה 1x עד שהבארות שקועות בנוזל. בעזרת פיפטה מפלסטיק, שוטפים את הבארות עם חיץ הריצה.
3. טען את הדגימות על הג'ל יחד עם סמן תקן 10 μL prestained.
4. מעבירים את הג'ל במתח של 200 וולט עד שחזית הצבע נמצאת במרחק של כ-1 ס"מ מתחתית הג'ל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16% ג'ל TGX פריקאסט	תרמופישר	Xp00160
ברומופנול כחול
BSA	איתות סלולרי	99985
מאגר ליזה של תאים	איתות סלולרי	9803
צנטריפוגה	אפנדורף	5415ד
DMEM	גיבקו	11330-032
EDTA	סיגמא אולדריץ'	M101
מכשיר אלקטרופורזה	Invitrogen	A25977
סרום בקר עוברי	גיבקו	1932693
פורמלדהיד	תרמופישר	28908
הומוגנייזר זכוכית-טפלון
גליצרול	סיגמא אולדריץ'	65516
גליצין	RPI	636050
Hepes	סיגמא אולדריץ'	H0527
יודואצטמיד	תרמופישר	90034
PBS	סיגמא אולדריץ'	עמ' 3813
ספק כוח	ביוראד	200120
סמן קבוע	תרמופישר	26619
SDS	ביוראד	161-0302
סוניקטור	ברנסון	450
בסיס טריס	RPI	T60040
טריס מלח חוצץ	סיגמא אולדריץ'	SRE0031	עם טווין 20, pH 7.5
מאגר ריצה Tris-Glycine	VWR	J61006
טריטון X-100	סיגמא אולדריץ'	T8787
מערכת ההפעלה U-2	ATCC	HTB-96