התמקדות איזואלקטרית בפאזה נוזלית: טכניקת אלקטרופורזה להפרדת מולקולות ביו-אקטיביות מתמצית ג'ימנמה סילבסטר גולמית

תקציר

מקור: Veerapandian, R., et al. הפרדת מולקולות קטנות ביו-אקטיביות, פפטידים ממקורות טבעיים וחלבונים ממיקרובים בשיטת מיקוד איזואלקטרי מכין (IEF). J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מתאר טכניקה להפרדת מולקולות מורכבות מתמציות צמחים באמצעות מיקוד איזואלקטרי בפאזה נוזלית. טכניקה זו מסייעת לטהר ביומולקולות מורכבות במצבן הטבעי, אשר ניתן להשתמש בהן עבור יישומים שונים במורד הזרם.

פרוטוקול

1. הפרדה וטיהור של מולקולות קטנות ופפטידים מתמצית Gymnema sylvestre

1. יש למדוד 0.6 גרם של תמצית צמחים ולהמיס במים מזוקקים (60 מ"ל) על ידי ערבוב בצינור רולר במשך 5 דקות.
   הערה: כל דגימה ביולוגית שהיא מסיסה ונטולת מלח יכולה לשמש להפרדה וטיהור באמצעות מכשיר מיקוד איזואלקטרי בפאזה נוזלית (IEF). דגימות עם ריכוז מלח חציצה עד 10 mM ניתן להשתמש עם רזולוציה מופחתת מעט.
2. צנטריפוגה את תמצית הצמח המסיס ב 10,000 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר חלקיקים מסיסים.
3. העבר את הסופרנאטנט (~ 60 מ"ל) לצינור צנטריפוגה של 80 מ"ל וערבב אותו עם 0.6 מ"ל אמפוליט (pH 3-10) ל -1% (v/v).
4. הכן את יחידת IEF בשלב נוזלי.
   1. הרכיבו את אלקטרודות IEF בשלב נוזלי (כפתור אדום אנודה וכפתור שחור קתודה) עם קרומי החילוף המתאימים להן בהתאם למדריך ההוראות (טבלת חומרים). אזנו את קרומי חילופי האניון עם 0.1 M NaOH ואת קרומי חילופי הקטיונים עם 0.1 M H₃PO₄ לפחות למשך 16 שעות כאשר משתמשים בקרומים חדשים.
   2. אחסנו את הממברנות באלקטרוליטים (0.1 M NaOH או 0.1 M H₃PO₄) בין ריצות ואל תאפשרו להן להתייבש.
   3. הרכיבו את החלק הפנימי והחיצוני של האלקטרודה על ידי יישור שלושה חורים מלבניים באטמים להחלפת יונים. מלא את האלקטרודות באלקטרוליטים המתאימים (~ 25-30 מ"ל) כדי למנוע מהממברנות שלהם להתייבש.
   4. אין להוסיף אלקטרוליט עודף (יותר מ-1/3 מנפח תא האלקטרודה) שעלול ליצור לחץ בתוך האלקטרודה ולגרום לדליפה.
   5. כסו את יציאות איסוף הדגימות בסרט איטום המגיע עם חלקי הרכבת המכשירים (Table of Materials). ניתן לזהות את צד יציאות איסוף הדגימה על ידי שני פיני היישור האנכיים של המתכת. לחלופין, השתמש בסרט איטום סטנדרטי כדי לאטום את היציאות.
   6. הרכיבו את כל חלקי מכלול תא המיקוד ברצף (אלקטרודת אנודה, ליבת קרום ניילון, תא מיקוד ואלקטרודה קתודית) מעל אצבע הקירור הקרמית.
   7. מלא את תא המיקוד במים מזוקקים מקוררים מראש (נפח כולל של 60 מ"ל עבור תא IEF סטנדרטי) באמצעות מזרק 50 מ"ל.
   8. חבר את מכשיר IEF בפאזה נוזלית למי קירור במחזור ב- 4 מעלות צלזיוס והפעל מראש את היחידה ב- 15 W ו- 3,000 V למשך 3-5 דקות או עד שהמתח מתייצב.
      הערה: בדרך כלל, תוך דקה אחת, המתח יגיע לערכים המרביים שנקבעו. הפעלה מקדימה עם מים מזוקקים מסייעת להסיר את היונים השיוריים מתא המיקוד וליבת קרום הניילון.
   9. כבה את מקור החשמל והסר את המים מהתא באמצעות קולט השברים. אטמו מחדש את פתחי האיסוף בעזרת סרט איטום. החדר מוכן כעת לטעון את הדגימה.
5. השתמש מזרק 50 מ"ל עם 1-1/2 אינץ '19 G מחט קצה קהה (מגיע עם המכשיר) ולטעון את הדגימה מוכנה עם אמפוליט (60 מ"ל בסך הכל) בתא דרך יציאות איסוף דגימה.
6. הסר בועות אוויר מתא הדגימה על-ידי הסרת תא המיקוד מהמעמד והקשה על תא האלקטרודה כדי לעקור את הבועות. נוכחות בועות אוויר תגרום לתנודות מתח וזרם ותשפיע על הריצה.
7. חבר את היחידה לנוזל קירור המים (4 ° C) והתחל שבירה עם ספק הכוח ב 15 W קבוע.
8. הפעל את המכשיר במשך 3 שעות או עד שהמתח מגיע לערך קבוע.
   הערה: כאשר הדגימה מתחילה להתמקד, המתח יתחיל לטפס בהדרגה עד שיגיע לערך קבוע.
9. לאחר הריצה, התכוננו לאסוף את השברים בקופסת הקציר (המכילה 20 צינורות פלסטיק, 12 מ"מ x 75 מ"מ, נפח 5-6 מ"ל) המחוברים למשאבת הוואקום על ידי לחיצה על כפתור הקציר מופעל ביחידת IEF.
10. ישר את 20 הפינים של האוסף עם 20 יציאות האוסף של תא המיקוד האטום באמצעות סרט הדבק.
11. דחפו את פיני האיסוף דרך סרט האיטום והפעילו את משאבת הוואקום בו-זמנית (איור 1B, 1C ו-1D).
    הערה: כ -3 שברים מ"ל מכל תא ייאספו לתוך הצינורות עבור כל פעם. ניתן להשתמש בשברים ליישומים הבאים במורד הזרם (SDS-PAGE לכימות פפטידים, TLC וביו-אסאי למולקולות קטנות).

תוצאות

איור 1: הגדרת מנגנון IEF בשלב נוזלי ושבירה של תמצית צמח G. sylvestre. (A) במהלך הריצה, (B) במהלך איסוף שברים, (C) לאחר איסוף שברים, ו-(D) חלקי מנגנון IEF בשלב נוזלי, 1) ממברנות חילופי יונים, 2) תא מיקוד וליבת ממברנה, 3) הרכבת אלקטרודות (שלילי), 4) הרכבת אלקטרודות (חיובי).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.45 מיקרומטר מסנן מזרק	פישר סיינטפיק	09-720-004
ביו-לייט 3/10 אמפוליט	ביו-ראד	163-1113
ביו-לייט 5/8 אמפוליט	ביו-ראד	163-1192
תרמוסטט קומפקטי בטמפרטורה נמוכה	לאודה -ברינקמן	RM 6T	כוונו את קירור המים ל-4°C וניתן יהיה להפעיל אותו אפילו ב-0°C מכיוון שכאשר הוא עובר דרך ליבת הקירור של Rotofor, טמפרטורת המים במחזור תהיה סביב 5 או יותר בהתאם למתח.
אבקת תמצית עלי צמח ג'ימנמה (>25% חומצות ג'ימנמיות)	סואן פארמה, ניו ג'רזי ארה"ב
מיני אלקטרופורזה פרוטיאנית	ביו-ראד
מד pH	מטלר טולדו	S20	שימושי כדי לקבוע את ה- pH של שברי Rotofor (IEF בשלב נוזלי)
רוטופור	ביו-ראד	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (מדריך הוראות Rotofor להרכבת היחידה)
RPMI-1640 בינוני	הייקלון	DH30255.01
סרט איטום	ביו-ראד	170-2960	ניתן להשתמש גם בסקוטש טייפ
Sorvall legend micro 17 צנטריפוגה	תרמו-מדעי	75002432