Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis: שיטה לניתוח אינטראקציות דגימה-ליגנד בהתאם לנדידה דיפרנציאלית של קומפלקסים חלבוניים-ליגנדים

תקציר

מקור: Nachbar M. et al., Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את השיטה לניתוח אינטראקציה בין חלבון-ליגנד על ידי אלקטרופורזה נימית של זיקה לניידות-משמרת. שיטה זו יכולה לשמש לאפיון התנהגות הקישור של חלבון עם ליגנדות טעונות שונות.

פרוטוקול

1. הכן את הפתרונות לניתוח ACE

1. הכינו את תמיסת 1 M NaOH.
   1. שוקלים 4.0 גרם NaOH בצלוחית נפחית של 100 מ"ל.
   2. מלאו אותו עד לסימן במים שעברו דה-יוניזציה כדי ליצור מלאי של 1 מטר.
2. הכינו את החומצה האתילאנדיאמינטטראאצטית (EDTA) באורך 0.1 M בתמיסת NaOH באורך 0.1 מ'.
   1. מעבירים 10 מ"ל של 0.1 מ"ל NaOH בבקבוק נפחי של 100 מ"ל באמצעות פיפטה של נורה 10 מ"ל. מלאו אותו עד לסימן במים נטולי יונים.
   2. שוקלים 2.42 גרם EDTA על סירת שקילה וממיסים את התרכובת המוצקה ב-100 מ"ל של 0.1 מ' NaOH.
3. הכן את תמיסת Tris buffer (30 mM).
   1. הוסיפו 3.63 גרם של טריס, 200 מ"ל של מים נטולי יונים, וחטיף ערבוב במיכל של 500 מ"ל. מניחים את הכד על צלחת ערבוב ומדליקים אותו.
   2. שים אלקטרודת מד pH בכד וכוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות 0.1 M HCl.
   3. ממלאים את התמיסה בבקבוק נפח 1 ליטר וממלאים עד הסימן במים נטולי יונים.
      הערה: יש לחזור על הליך זה או שיש צורך בבקבוק נפחי גדול יותר מכיוון שיש צורך ביותר מ -1 ליטר לכל הניתוח.
4. הכינו את תמיסת סמן הזרימה האלקטרואוסמוטית (EOF) של אצטניליד (60 מיקרומטר).
   1. הוסף 6 מ"ג של אצטניליד ו 100 מ"ל של חיץ Tris בבקבוק נפח 100 מ"ל.
   2. שים את בקבוק volumetric באמבטיה קולית ולהפעיל אותו במשך 30 דקות.
5. הכינו את תמיסת הדגימה (1 מ"ג/מ"ל).
   1. שים צינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מ"ל על איזון מדויק והוסף 0.3 מ"ג של אבקת AtHIRD11 מיובשת בהקפאה לתוך הצינור.
   2. השתמש מיקרופיפטה כדי להוסיף 0.3 מ"ל של מאגר Tris 30 mM (pH 7.4) בצינור. נערו את הצינורית בזהירות כדי להמיס את החלבון.
6. הכינו את פתרונות הליגנד.
   1. הכן את תמיסת מלאי CaCl₂ (5 mM).
      1. קח סירת שקילה, שים אותה על איזון אנליטי ולשקול 36.76 מ"ג של CaCl₂ * H₂O.
      2. באמצעות מיקרופיפטה, שטפו את CaCl₂*H₂O מסירת השקילה לתוך בקבוק נפח של 50 מ"ל עם חיץ Tris שהוכן מראש.
      3. מלאו את הבקבוק הנפחי במאגר Tris עד לסימן.
   2. הכן את פתרונות המלאי הנותרים (5 מ"מ).
      1. חזור על שלב 1.6.1 באמצעות מלחי המתכת האחרים במקום CaCl₂*H₂O [MgCl₂: 23.80 מ"ג, BaCl₂: 26.02 מ"ג, Sr(NO₃)₂: 52.91 מ"ג, MnCl₂: 31.46 מ"ג, SeCl₄: 52.91 מ"ג, CoCl₂*2H₂O: 41.47 מ"ג, CuCl₂*2H₂O: 42.62 מ"ג, ZnCl₂: 3.41 מ"ג ו-NiCl₂*6H₂O: 59.43 מ"ג].
         הערה: לתמיסת ZnCl₂ יש ריכוז של 0.5 mM. מכיוון שנצפו אינטראקציות חזקות בין היונים לבין דופן הנימים הפנימית, הריכוז הופחת פי 10⁴.
   3. הכן את תמיסת CaCl₂ בגודל 500 מיקרומטר.
      1. מלא 10 מ"ל של תמיסת המניות CaCl₂ ושים אותו בצלוחית נפחית של 100 מ"ל.
      2. ממלאים את הבקבוק הנפחי בחיץ טריס לסימן ומנערים את הצלוחית.
   4. הכן את תמיסת CaCl₂ בגודל 250 מיקרומטר.
      1. מלא 5 מ"ל של תמיסת המניות CaCl₂ ושים אותו בבקבוק נפח של 100 מ"ל.
      2. ממלאים את הבקבוק הנפחי בחיץ טריס לסימן ומנערים את הצלוחית.
   5. חזור על השלבים הקודמים עבור פתרונות המניות האחרים.
7. מלא את הפתרונות בבקבוקונים.
   הערה: כל ריצה חוזרת דורשת סט של בקבוקוני כניסה ויציאה. השימוש בתמיסות ליגנד טריות בכניסה וביציאה מפחית את זמני הנדידה לאחר כל ריצה.
   1. מלא את תמיסת CaCl₂ בגודל 250 מיקרומטר במזרק של 10 מ"ל.
   2. שים מסנן PVDF 0.22 מיקרומטר על המזרק ודחוף 2 מ"ל של התמיסה דרך המסנן באמצעות המזרק על מנת להשליך את התמיסה המסוננת.
   3. מלא 10 בקבוקונים עד לנפח המרבי המותר בתמיסת CaCl₂ הנותרת של 250 מיקרומטר של המזרק. סמן כל אחד מהם כבקבוקון כניסה של תמיסת CaCl₂ בגודל 250 מיקרומטר.
   4. מלאו 10 בקבוקונים עד שהם מלאים למחצה בתמיסת CaCl₂ בגודל 250 מיקרומטר. סמן כל אחד מהם כבקבוקון שקע פתרון CaCl₂ של 250 מיקרומטר.
   5. חזור על שלבים 1.7.1 - 1.7.4 עבור תמיסות מלח מתכת אחרות.
   6. חזור על השלבים עבור כל זוג בקבוקוני כניסה ויציאה באמצעות פתרון מאגר Tris של 30 mM (pH 7.4) במקום זאת.
      הערה: 30 mmol / L Tris buffer pH 7.4 משמש בין הריצות כדי לקבל נתוני זמן נדידה עבור החלבון בהיעדר יוני מתכת. יש צורך להזניח שינויים EOF.
   7. חזור על השלבים לעיל עבור בקבוקון אחד באמצעות תמיסת סמן EOF-אצטניליד (60 מיקרומטר) במקום זאת. כמו כן, חזור על שלבים אלה באמצעות תמיסת הדגימה (1 מ"ג / מ"ל) במקום זאת.

2. אנליזה אלקטרופורטית קפילרית זיקה

1. מצב את הנימים
   1. כוונו את התרמוסטט ל-23°C.
      הערה: הטמפרטורה משמשת על פי פרוטוקולים שפורסמו וניתן לשנות אותה לטמפרטורות אחרות. עם זאת, האינטראקציות תלויות בטמפרטורה וישתנו בהתאם.
   2. שוטפים נימים למשך 40 דקות ב-2.5 בר עם 0.1 M NaOH.
   3. שוטפים את הנימים למשך 10 דקות בבר 1.0 עם מים נטולי יונים.
   4. שטפו את הנימים למשך 30 דקות ב-1.0 בר עם חיץ Tris של 30 מילימטר (pH 7.4).
2. הכנה לשיטות ACE
   1. הכינו את השיטה למדידות ללא ליגנדות.
      הערה: אצטניליד לא נוסף לתמיסת הדגימה, מכיוון שהוא מסווה 2 פסגות חלבון.
      1. שטפו את הנימים במשך דקה אחת ב-2.5 בר עם תמיסת EDTA באורך 0.1 מטר.
      2. שטפו את הנימים במשך דקה אחת ב-2.5 בר עם מים נטולי יונים.
      3. שטפו את הנימים במשך 1.5 דקות ב-2.5 בר עם חיץ Tris לאיזון.
      4. הזריקו את תמיסת האצטניליד למשך 6 שניות ב-0.05 בר והחליפו את בקבוקוני הכניסה והיציאה לבקבוקוני החיץ Tris.
      5. החל 0.05 בר במשך 2.4 שניות על מנת לדחוף את תמיסת אצטניליד מקצה הנימים עוד יותר פנימה.
      6. החל 10.0 kV במשך 6 דקות וזהה את שיא האצטניליד באורך גל של 200 ננומטר.
      7. חזור על שלבים 2.2.1.1. - 2.2.1.6. שימוש בדגימת החלבון במקום בתמיסת אצטניליד וזיהוי כל פסגות החלבון.
   2. הכינו את השיטה למדידות עם ליגנדות.
      1. שטפו את הנימים במשך דקה אחת ב-2.5 בר עם תמיסת EDTA באורך 0.1 מטר.
      2. שטפו את הנימים במשך דקה אחת ב-2.5 בר עם מים נטולי יונים.
      3. שטפו את הנימים במשך 1.5 דקות ב-2.5 בר עם תמיסת הליגנד לאיזון.
      4. הזריקו את תמיסת האצטניליד למשך 6 שניות ב-0.05 בר והחליפו את בקבוקוני הכניסה והיציאה לבקבוקוני החיץ המכילים ליגנד.
      5. החל 0.05 בר במשך 2.4 שניות על מנת לדחוף את תמיסת אצטניליד מקצה הנימים עוד יותר פנימה.
      6. החל 10.0 kV במשך 6 דקות וזהה את שיא האצטניליד באורך גל של 200 ננומטר.
      7. חזור על שלבים 2.2.2.1 - 2.2.2.6 באמצעות דגימת החלבון במקום תמיסת אצטניליד וזהה את כל פסגות החלבון.
   3. חזור לסירוגין על שלבים 2.2.1 ו- 2.2.2 כדי לחשב את השינוי ביחסי גודל המטען עבור אינטראקציות יוני חלבון-מתכת השונות.
      1. שנה את תמיסת החלבון לאחר כל 60 שעות לתמיסת חלבון טרייה.
         הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי. הליך זה חוזר על עצמו לפחות פי 10 עבור כל ריכוז של הליגנדות מכיוון שדפוס השיא משתנה מעט מריצה לריצה. אם הפתרון משמש יותר מ 60 שעות, וריאציות להיות גדול מדי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדגם AtHIRD11	אוניברסיטת שיזואוקה (קבוצת פרופ' מ. הרה)		חלבון דהידרין מ-Arabidopsis thaliana מבוטא ב-Escherichia coli
נימי סיליקה מסורבים,	פולימיקרו טכנולוגיות (פיניקס, ארה"ב)	106815-0017	TSP050375 קוטר פנימי 50 מיקרומטר, קוטר חיצוני 363 מיקרומטר, ציפוי פולימיד
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, גרמניה)		מכשיר אלקטרופורזה נימי; ניתן להשתמש ב- Agilent 7100 CE במקום
פיפטה נורה 25 מ"ל	Duran Group GmbH(מיינץ, גרמניה)	24 338 14	הכנת פתרון הליגנד
דוראן גלאס בקבוק נפח 25 מ"ל	Duran Group GmbH(מיינץ, גרמניה)	24 671 1457	הכנת פתרון מלאי הליגנד
דוראן גלאס בקבוק נפח 10 מ"ל	Duran Group GmbH(מיינץ, גרמניה)	24 671 1054	הכנת פתרון מלאי הליגנד
אצטניליד	סיגמא-אולדריץ' (Steinheim, גרמניה)	397229-5G	סמן זרימה אלקטרואוסמוטי
מנגן (II) כלוריד	סיגמא-אולדריץ' (Steinheim, גרמניה)	13217	ליגנד
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)	סיגמא-אולדריץ' (Steinheim, גרמניה)	431788-100 גרם	מרכיב שטיפה
בריוםכלוריד	סיגמא-אולדריץ' (Steinheim, גרמניה)	202738-5G	ליגנד
ניקל(II) כלוריד הקסהידראט	סיגמא-אולדריץ' (Steinheim, גרמניה)	654507-5G	ליגנד
סלניום (IV) כלוריד	סיגמא-אולדריץ' (Steinheim, גרמניה)	323527-10G	ליגנד
2-אמינו-2-הידרוקסימתילפרופאן-1.3-דיול (טריס)	סיגמא-אולדריץ' (Steinheim, גרמניה)	252859-100 גרם	מרכיב חיץ
אבץ(II) כלוריד	Merck Millipore ( דרמשטאדט, גרמניה)	1088160250	ליגנד
סטרונציום חנקתי	Merck Millipore ( דרמשטאדט, גרמניה)	1078720250	ליגנד
סידן כלורי דיהידראט	Merck Millipore ( דרמשטאדט, גרמניה)	1371015000	ליגנד
נחושת(II) כלוריד דיהידראט	Riedel-de Haën (Seelze, גרמניה)	31286	ליגנד
Agilent ChemStation מהדורה 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, גרמניה)	G2070-91126	חבילות תוכנה להפעלת מכשירי CE, רכישת נתונים והערכתם