אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

תקציר

מקור: Zhan, X., et al. אלקטרופורזה ג'ל דו-מימדית בשילוב עם שיטות ספקטרומטריית מסות לניתוח של רקמת אדנומה של יותרת המוח האנושית Proteome J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

פרוטוקול

1. הכנת דוגמאות

1. לאסוף רקמות אדנומה יותרת המוח (0.2 - 0.5 מ"ג) מהמחלקה הנוירוכירורגית. מיד להקפיא בחנקן נוזלי, ולאחר מכן להעביר ל -80 °C לאחסון.
2. הוסף 2 מ"ל של 0.9% NaCl למים מזוקקים נטולי יונים. השתמש בתמיסה זו כדי לשטוף קלות את הדם מפני הרקמה (3x).
   NOTE: ddH₂O עם מוליכות של 18.2 MΩ/cm משמש לאורך כל הפרוטוקול. חלק מהרקמה עלול ללכת לאיבוד בעת שטיפת דם מפני השטח של רקמה.
3. הוסף נפח (10 מ"ל; 4 ° C) של התמיסה המכילה 2 M חומצה אצטית ו 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol עבור כל 0.5 - 0.6 גרם של רקמה, homogenize (1 דקות, 13,000 סל"ד, 4 ° C, 10x) עם הומוגנייזר רקמות, sonicate homogenate במשך 20 s, lyophilize, ולאחסן ב -80 ° C.
4. מדוד את תכולת החלבון של הדגימות ההומוגניות שעברו ליופיליזציה באמצעות ערכת בדיקה של חומצה ביכונית (BCA).
   הערה: כימות BCA אינו כימות מוחלט, והתוצאה הנמדדת תשתנה עם טכנאי אחר וסוכן הניסוי. יש להשתמש בתקן דגימת ריכוז קבוע לניסויים שונים. לכן, כמות ההעמסה הסופית של חלבונים עבור כל ג'ל דו-ממדי תיקבע עם התמונה ברזולוציה טובה מוכתמת כסף או מוכתמת קומאסי בניסויים שתוכננו מראש.
   1. הוסף כ -300 מיקרוגרם של הדגימה ההומוגנית הליופילית לנפח אחד (282 מיקרוליטר) של מאגר מיצוי חלבון (8 M אוריאה ו -4% CHAPS), ואחריו עומד במשך שעתיים, סוניק באמבט מים במשך 5 דקות, מסתובב במשך 1 שעה, sonicating שוב באמבט המים במשך 5 דקות, מסתובב שוב במשך 1 שעה, וצנטריפוגה במהירות של 15,000 x גרם למשך 20 דקות.
   2. הכנת תמיסות בתקן BSA בריכוזים כאמור: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1,500, 2,000 מיקרוגרם/מ"ל בתקן BSA מסחרי (2 מ"ג/מ"ל).
   3. ערבב מגיב BCA A ו- B (A:B = 50:1) כפתרון עבודה BCA לפני השימוש.
   4. הוסף 0.1 מ"ל של הדגימה או התמיסה הסטנדרטית ל- 2 מ"ל של תמיסת עבודה BCA בצינור מיקרופוגה, ולאחר מכן ערבוב ולאחר מכן דגירה ב- 37 ° C למשך 30 דקות. לבסוף קריר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ולמדוד ערך O.D_{562 ננומטר}.
   5. חשב את הקו הליניארי הסטנדרטי (ריכוז A_{562 ננומטר} לעומת BSA) כדי לקבל משוואת רגרסיה לחישוב תכולת חלבון הדגימה בערך A_{562 ננומטר}.
5. יש להשתמש ב-150 מיקרוגרם של הדגימה המקבילה לחלבון עבור צביעת כסף, או 500 מיקרוגרם חלבון עבור צביעת קומאסי, עבור רצועת pH משותקת של 18 ס"מ (IPG) pH 3-10 לא ליניארית (NL).
   הערה: הרצועה היבשה IPG היא בעובי 0.5 מ"מ וברוחב 3 מ"מ, באורכים שונים כולל 7, 11, 13, 18 ו-24 ס"מ, וטווחי pH שונים כולל pH 4-5, 4-7, 6-9 ו-3-10 בשיפוע pH ליניארי או לא ליניארי. מאגר ה- IPG המשמש חייב להתאים לרצועה.
6. יש להוסיף 250 מיקרוליטר של חיץ מיצוי (7 M אוריאה, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 100 mM DTT (יש להוסיף לפני השימוש), 0.5% v/v pharmalyte (להוסיף לפני השימוש) וקורט של bromophenol blue).
7. שמור את התמיסה מתחת ל-30°C, ולאחר מכן מערבל במשך 5 דקות, סוניק במשך 5 דקות ומסתובב במשך 50 דקות.
8. יש להוסיף 110 מיקרוליטר של חיץ החזרת נוזלים (7 M אוריאה, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 60 mM DTT (יש להוסיף לפני השימוש), 0.5% v/v IPG buffer (יש להוסיף לפני השימוש) וקורט של ברומופנול כחול). סוניק למשך 5 דקות. לאחר מכן סובב את הדגימה במשך 50 דקות, מערבולת במשך 5 דקות, וצנטריפוגה במשך 20 דקות ב 15,000 x גרם.
9. אספו את הסופרנאטנט (350 μL) כתמיסת דגימת החלבון.

2. אלקטרופורזה ג'ל דו מימדי

1. IEF (ממד ראשון): ביצוע IEF על מערכת מיקוד איזואלקטרית כמתואר להלן.
   1. הוסף 350 μL של תמיסת דגימת החלבון בחריץ של מחזיק רצועת IPG בגודל 18 ס"מ.
   2. הניחו פס IPG בקוטר 18 ס"מ על תמיסת דגימת החלבון (הימנעו מבועות).
   3. מוסיפים 3-4 מ"ל שמן מינרלי כדי לכסות את רצועת ה-IPG.
   4. הרכיבו את מחזיק רצועת ה-IPG למערכת המיקוד האיזואלקטרית כאשר הקצה המחודד על הלוח האחורי (+) והקצה המרובע על הלוח הקדמי (−).
   5. יש לייבש למשך הלילה (~ 18 שעות בטמפרטורת החדר).
   6. הגדר את פרמטרי IEF: זרם מרבי 30 μA לרצועה, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, צעד והחזק; 1,000 V, 1 שעות, 500 Vh, הדרגתי; 8,000 V, שעה אחת, 4,000 Vh, הדרגתי; 8,000 V, 4 שעות, 32,000 Vh, צעד והחזק; ו- 500 V, 0.5 שעות, 250 Vh, צעד והחזק. תן לו לרוץ עד זמן כולל של 7.5 שעות ו 36,875 Vh.
   7. לאחר IEF, הוציאו כל רצועת IPG והסירו את השמן המינרלי הנוסף עם מגבת נייר בלתי מסיסה. כעת עטפו את הרצועה ביריעת ניילון נצמד, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: יש לנקות את מחזיק רצועת ה- IPG עם תמיסת ניקוי מחזיק רצועת IPG ומים מזוקקים.
2. SDS-PAGE (ממד שני): ביצוע SDS-PAGE במערכת אלקטרופורזה של תא אנכי
   הערה: כל גודל ג'ל SDS-PAGE צריך להיות 255 x 190 x 1 מ"מ.
   1. השתמש יציקת מולטי ג'ל כדי ליצוק 12% ג'ל פותר PAGE. ליציקת ג'ל 12% PAGE, בצע את השלבים הבאים.
      1. הוסף 270 מ"ל של ddH₂O, 150 מ"ל של 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 180 מ"ל של 40% (w/v) תמיסת מלאי אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1, 40% עם אקרילאמיד ו-1.38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 מ"ל של 10% אמוניום פרסולפט, ו-150 מיקרוליטר של TEMED כדי ליצור את תמיסת הג'ל בכד. מערבבים בעדינות ונמנעים מבועות.
      2. יוצקים את תמיסת הג'ל בעדינות לתוך תא השידור עד לגובה הג'ל הצפוי (19 ס"מ).
      3. מיד להוסיף על 3 מ"ל ddH₂O על כל ג'ל פתרון כדי לכסות את הג'לים. תן לג'ל להתפלמר במשך כשעה.
   2. הכינו 20 ליטר של חיץ אלקטרופורזה (25 mM Tris, 192 mM גליצרין ו-0.1% SDS). מלא את מיכל החיץ של יחידת הפרדת האלקטרופורזה במאגר זה.
   3. הוציאו את רצועות ה-IPG הממוקדות מהמקפיא ואזן את הרצועות למשך 10 דקות על ידי נדנוד עדין ב-4 מ"ל של חיץ הפחתת שיווי משקל (375 מילימטר Tris-HCl (pH 8.8), 6 M אוריאה, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) גליצרול, 2% w/v DTT (יש להוסיף לפני השימוש) וקורט ברומופנול כחול).
   4. יש לאזן למשך 10 דקות על ידי נדנוד עדין של רצועות ה-IPG המופחתות במאגר שיווי משקל אלקילציה של 4 מ"ל (375 מילימטר Tris-HCl (pH 8.8), 6 M אוריאה, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) גליצרול, 2.5% w/v יודואצטמיד (יש להוסיף לפני השימוש) וקורט של ברומופנול כחול).
   5. במהלך שיווי משקל ג'ל, לפרק את תא multicasting, ולהוציא את קלטת ג'ל פתרון מוכן. יש לשטוף 3x עם ddH₂O. להסיר עודפי ddH₂O עם מגבת נייר בלתי מסיסה ולשים בסטנדר ג'ל.
   6. שטפו את רצועות ה-IPG המאוזנות עם חיץ אלקטרופורזה והסירו עודפי נוזלים על משטח רצועת ה-IPG עם מגבת הנייר הבלתי מסיסה.
   7. הניחו פס IPG על ג'ל SDS-PAGE הפותר ותנו לצד הפלסטיק של רצועת ה-IPG לגעת בצלחת הזכוכית הארוכה יותר ובקצה המחודד משמאל.
   8. יש לשפוך 3-4 מ"ל של אגרוז חם 1% במאגר אלקטרופורזה SDS (~80°C) במהירות כדי לאטום את רצועת ה-IPG בחלק העליון של כל ג'ל SDS-PAGE, ולהניח את הצד העליון של רצועת IPG כלפי מטה לחלק העליון של צלחת הזכוכית הקצרה יותר ללא בועות, ולאחר מכן להתפלמר למשך 10 דקות.
   9. הכנס את קסטת הג'ל המורכבת במאונך בין אטמי פלסטיק במערכת האלקטרופורזה האנכית. שים את החלק העליון של הג'ל עם רצועת IPG ליד הקתודה (−).
   10. התאם את רמת מאגר האלקטרופורזה כדי לטבול את קלטת הג'ל.
   11. חבר והגדר את יחידת ספק הכוח/בקרה למצב מתח קבוע והפעל במתח של 200 וולט למשך כ-370 דקות תוך ניטור הצבע.
   12. לאחר הריצה, הוציאו את קסטת הג'ל ממערכת האלקטרופורזה, והסירו בעדינות את הג'ל מקסטת הג'ל, תוך הימנעות מקריעת הג'ל, ולאחר מכן הכתמה של חלבונים המופרדים באמצעות 2DE.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
איתן IPGphor 3	GE שירותי בריאות		מערכת מיקוד איזואלקטרית.
מערכת ETTAN DALT II	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, ניו ג'רזי, ארה"ב (ארצות הברית)		מערכת האלקטרופורזה האנכית
מחזיק רצועת IPGphor איתן	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, ניו ג'רזי, ארה"ב (ארצות הברית)
איתן DALTsix מטיל מולטיג'ל	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, ניו ג'רזי, ארה"ב (ארצות הברית)		יציקת מולטיג'ל
KimWipe	קימוויפה		מגבת נייר בלתי מסיסה
מים	מיוצר על ידי מכשיר PURELAB flex
פוליטרון דגם P710/35 הומוגנייזר	Brinkmann Instruments , ווסטבורי, ניו יורק
ערכת בדיקת חלבון פירס BCA	תרמו פישר סיינטיפיק	23227
ערכת קוונט דו-ממדית	GE שירותי בריאות	80-6483-56
ביס-אקרילאמיד	אמרסקו	0172
אקרילאמיד	אמרסקו	0341
DTT	סיגמא-אולדריץ'	D0632
טיוראה	סיגמא-אולדריץ'	T8656
אוריאה	VETEC	V900119
SDS	אמרסקו	0227
בחורים	אמרסקו	0465
טמד	אמרסקו	M146
אמוניום פרסולפט	אמרסקו	M133
חיץ IPG pH 3-10, NL	GE שירותי בריאות	17-6000-87
אימובילין רצועה יבשה pH 3-10NL, 18cm	GE שירותי בריאות	17-1235-01