אלקטרופורזה של ג'ל זימוגרפיה: טכניקה אלקטרופורטית לזיהוי מטאלופרוטאזות מטריקס על ידי הערכת הפעילות האנזימטית

תקציר

מקור: Hu, X. et al., Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography. J. Vis. Exp. (2010)

סרטון זה מדגים את טכניקת אלקטרופורזה של ג'ל זימוגרפיה כדי להעריך את הפעילות של מטלופרוטאזות מטריצה (MMPs) הקיימות בתרביות תא. ה-MMPs הפעילים מפרקים את המצע הספציפי ל-MMP המוטבע בג'ל פוליאקרילאמיד, המופיע כפסים שקופים על רקע מוכתם כהה לאחר הצביעה.

פרוטוקול

1. העמסה והפעלה של הג'ל

1. יש להכין את כל הדגימות כראוי כדי לשמור על תפקוד האנזימים ולהשתמש בהן מיד לאחר האיסוף או לאחסן קפואות בטמפרטורה של -80°C. אסור שהדגימות יכילו חומרים מחזרים (כגון β-מרקפטואתנול) או להרתיח אותן לפני העמסת ג'ל.
2. פתחו את השקית המכילה ג'ל בתוך קלטת, שטפו את הקלטת במים נטולי יונים.
   1. הסר את סרט המגן מתחתית הקלטת ואת המסרק מהחלק העליון של הג'ל.
   2. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם חיץ זורם (מדולל ל-1X במים נטולי יונים).
   3. הכניסו את הג'ל לתוך ה-Mini-Cell, וודאו שהצד הקטן יותר של הקלטת פונה פנימה. יש לנעול את מקומו עם טריז המתח של הג'ל. ה- Mini-Cell מאפשר להפעיל ג'ל אחד או שניים במקביל.
   4. מלא את החדר העליון (הפנימי) עם חיץ פועל 1X מעל גובה הבארות, בדוק אם יש נזילות. במקרה של דליפות, הסר את החיץ ומקם מחדש את הג'ל.
   5. מלא את החדר התחתון במאגר פועל 1X.
3. לטעון 10 μL של סמן מולקולרי חלבון בבאר אחת.
   1. מערבבים כמות שווה של חיץ העמסת ג'ל ושל דגימה ומעמיסים לתוך בארות הג'ל באמצעות קצוות העמסת ג'ל (משתנים בין כל דגימה). בארות אלה ניתן לטעון עם עד 20 μL בסך הכל.
4. הנח את המכסה על ה-Mini-Cell וחבר את כבלי האלקטרודה לספק הכוח. הפעל את ספק הכוח והגדר אותו לפעול במתח קבוע של 125 וולט למשך 90 דקות. בדוק את היווצרותן של בועות קטנות על חוט החדר התחתון, המציין את זרימת הזרם.
5. בעת הפעלת הג'ל הראשון שלך, עקוב אחר התקדמות המעבר כל 15 דקות, תוך שימוש בכחול ברומופנול הכלול במאגר ההעמסה כאינדיקטור. תן לג'ל לרוץ עד צבע מחוון מגיע לתחתית הג'ל.

2. חידוש ופיתוח הג'ל

1. עבור כל ג'ל, להכין 100 מ"ל של 1X חיץ renaturing ו 200 מ"ל של חיץ denaturing, שניהם במים deionized.
2. כאשר צבע המעקב הכחול של הברומופנול מגיע לתחתית הג'ל, כבה את ספק הכוח, פתח את ה-Mini-Cell והסר את הג'ל. מפרידים את שני צידי הקלטת בעזרת סכין הג'ל (או מרית שקילה). חותכים פינה כדי לסמן את כיוון הג'ל.
3. בזהירות להסיר את הג'ל מן הקלטת, ומניחים לתוך מיכל עם 100 מ"ל חיץ reaturing. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
4. הסר את המאגר מחדש והוסף 100 מ"ל של חיץ מתפתח לג'ל. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
5. הסר את המאגר המתפתח והוסף 100 מ"ל נוספים של חיץ מתפתח לג'ל. יש לדגור למשך הלילה (16-18 שעות) ב-37°C.
6. יש להסיר את החיץ המתפתח ולשטוף שלוש פעמים (5 דקות כל אחת) במים נטולי יונים, תחת תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר.
7. סרוק את הג'ל כדי לשמור את המיקום המדויק של רצועות תקן החלבון, מכיוון שהן יהפכו לפחות או לא נראות לעין לאחר צביעת הג'ל.
8. הכתימו את הג'ל על ידי הוספת 20 מ"ל של SimplyBlue Safestain לג'ל. יש לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה.
9. הסירו את SimplyBlue SafeStain והסירו את הכתמים מהג'ל במים שעברו דה-יוניזציה בכמות של 100 מ"ל או יותר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה.
10. לתוצאות טובות יותר, יש להחליף במים טריים שעברו דה-יוניזציה ולדגור במשך שעה נוספת או יותר בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכשיר אלקטרופורזה סימן Xcell SureLock Mini-Cell CE	Invitrogen	EI0001
ספק כוח (דגם 302)	VWR	93000-744
Novex 10% ג'ל זימוגרפיה ג'לטין, 1.0 מ"מ, 12 בארות	Invitrogen	EC61752BOX
מאגר העמסת ג'ל מיץ כחול	Invitrogen	10816015
טיפים להעמסת ג'ל	VWR	53509-015
חלבון משקל מולקולרי סטנדרטי	Invitrogen	LC5800
מאגר הפעלה Novex Tris-Glycine-SDS	Invitrogen	LC2675
Novex zymogram renaturing buffer	Invitrogen	LC2670
פיתוח חיץ זימוגרפיה Novex	Invitrogen	LC2671
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060