Multianalyte Immunobead Assay: טכניקת Immunoassay מבוססת זרימה לזיהוי בו-זמני של תת-סוגים מרובים של נוגדנים בדגימת סרום אנושי

תקציר

מקור: Fhied, C. L. et al., ניטור דינמי של המרת סרוקונפורמציה באמצעות בדיקת Immunobead Multianalyte עבור Covid-19. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מתאר טכניקת בדיקה חיסונית באמצעות חרוזים מגנטיים פלואורסצנטיים או מיקרוספרות בשילוב עם אנטיגנים שונים כדי לזהות בו זמנית איזוטיפים שונים של נוגדנים בדגימת סרום. הבדיקה מועילה בהבנת המרת סרוקונפורמציה במהלך זיהום או לאחר חיסון.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכנת מיקרוספרות מצומדות אנטיגן

1. בחר שלושה בקבוקונים שונים של מיקרוספרות מגנטיות עם אזורי חרוזים ייחודיים, רישום מזהה חרוז ומידע הרבה עבור כל בקבוקון בשימוש.
   הערה: השלבים הבאים יבוצעו עבור כל אזור מיקרוספירה נפרד. מיקרוספרות רגישות לאור ויש להגן עליהן מפני חשיפה ממושכת לאור. במהלך שלבי השטיפה, היזהר לא להפריע microspheres. אם מפריעים, אפשר הפרדה שנייה של 60 שניות.
2. מערבבים את מלאי המיקרוספירה במשך 60 שניות וסוניק במשך 5 דקות לפני השימוש כדי לנתק חרוזים מצטברים.
3. העבר 1.0 x 10⁶ חרוזים לצינורות מיקרוצנטריפוגות קושרות חלבון דלות 1.5 מ"ל.
4. הכניסו את הצינור למפריד מגנטי ואפשרו הפרדה למשך 60 שניות. כאשר הצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולת החרוזים.
5. הסר את הצינור מהמפריד המגנטי, השעה מחדש את החרוזים עם 100 μL של מים ברמת HPLC, ומערבול במשך 30 שניות. החזיר את הצינור למפריד המגנטי למשך 60 שניות, ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט. חזור על פרוטוקול כביסה זה פעמיים.
6. הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והשהה מחדש את המיקרוספרות שנשטפו ב 90 μL של 100 mM מונובייסיק נתרן פוספט, pH 6.2 (מאגר הפעלה) על ידי מערבולת במשך 30 שניות.
7. הוסף 10 μL של 50 מ"ג/מ"ל Sulfo-NHS (מדולל עם Activation Buffer) למיקרוספרות ולמערבולות בעדינות במשך 10 שניות. הוסף 10 μL של תמיסת EDC של 50 מ"ג/מ"ל (מדולל עם Activation Buffer) ומערבל בעדינות במשך 10 שניות. דגור על מיקרוספרות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם מערבולת עדינה כל 10 דקות.
8. חזור על שלבי השטיפה 1.4-1.5 עם 50 mM MES, pH 5.0 (חוצץ צימוד) במקום מים בדרגת LC/MS למשך שתי שטיפות בסך הכל.
9. הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והשהה מחדש את החרוזים עם 100 μL של חיץ צימוד על ידי מערבולת במשך 30 שניות ולאחר מכן מיד לאחר מכן תוספת של כמות הרצויה של חלבון.
10. הבא את הנפח הכולל ל- 150 μL עם מאגר צימוד. מערבבים תגובת צימוד על ידי מערבולת במשך 30 שניות ודגרים במשך שעתיים על ידי סיבוב ב- RT.
    הערה: עבור בדיקות שהוגדרו כאן, בוצעו הטיות עם ריכוזי החלבון הבאים: Spike S1: 5 μg; נוקלאוקפסיד: 5 מיקרוגרם; ממברנה: 12.5 מיקרוגרם.
11. יש לחזור על שלב 1.4 של השטיפה עם מלח חוצץ פוספט (PBS)-1% אלבומין בסרום עיזים, 0.01% פוליסורבט-20 (מאגר קוונץ') במקום מים בדרגת LC/MS למשך שתי שטיפות בסך הכל. השהה מחדש את המיקרוספרות שנשטפו ב 100 μL של מאגר Quench המכיל 0.05% נתרן אזיד על ידי מערבולת עבור 30 s.
    הערה: הרשו לחרוזים להרוות באופן מלא במשך 6 שעות לפחות לפני שהמשיכו לכל הליך אחר.
12. ספור את מספר המיקרוספרות שהתאוששו באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר. רשום את ריכוז החרוזים שנצפה.
13. יש לקרר את המיקרוספרות המצומדות בטמפרטורה של 4°C בחושך.

2. נהלים

1. ביצועי Assay (פרוטוקול בסיס)
   1. השהה מחדש את המיקרוספרות המצומדות על ידי מערבולת למשך 30 שניות וסוניקט במשך ~60-90 שניות.
   2. הסר את הכמות הנדרשת של כל קולואיד חרוזים מהצינור המתאים ושלב את קולואיד החרוזים בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל
   .
   3. הכניסו את הצינור למפריד מגנטי ואפשרו להפרדה להתרחש למשך 60 שניות. כאשר הצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולת החרוזים.
   4. הסר את החרוזים מהמפריד, השהה מחדש את החרוזים עם 100 μL של אלבומין בסרום PBS-1% בקר, 0.01% Polysorbate-20 (מאגר Assay), ומערבולת במשך 30 שניות. הכנס את הצינור למפריד מגנטי ואפשר הפרדה למשך 60 שניות. חזור על פרוטוקול כביסה זה (כלומר, שלבים 2.1.3-2.1.4) פעמיים.
   5. התאם את הריכוז של תערובת המיקרוספירה העובדת 3-plex על ידי הוספת נפח מתאים של מאגר Assay כדי ליצור ריכוז סופי של 100 מיקרוספרות לכל 1 μL עבור כל מטרה.
   6. Aliquot 12.5 μL של תערובת מיקרוספירה מוכן בשלב 2.1.5 לתוך כל באר של צלחת 384 באר או 25 μL לתוך כל באר של צלחת 96 באר
   .
   7. לדלל את דגימות הפלזמה/סרום פי 500 במאגר Assay. הכינו דגימות סטנדרטיות בהתאם לטיטרציה הרצויה.
   8. הוסף 12.5 μL של חיץ Assay כדגימה ריקה והוסף כל דגימה מדוללת או תקן לכל באר ייעודית של צלחת דגימה של 384 בארות או 25 μL של הדגימה הריקה, המדוללת או הסטנדרטית לכל באר של צלחת דגימה של 96 באר.
   9. כסו את הצלחת באטם אלומיניום או בנייר כסף ודגרו במשך שעה אחת ב-RT על שייקר צלחות המכוון ל-700 סל"ד.
      הערה: סכמה לעקומות הדילול מוצגת בטבלה 1.
   10. הכן תמיסה של נוגדנים לזיהוי אנטי אנושי (תמיסות נוגדנים משניים) ב 4 מיקרוגרם / מ"ל עם מאגר Assay כמפורט בשלב 2.1.11.
   11. הכינו IgM אנטי-אנושי עז, מצומד עם Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) נוגדנים מצומדים לגילוי ב-4 מיקרוגרם/מ"ל; או IgM אנטי-אנושי עז, SB מצומד / עז אנטי אנושי IgG, PE מצמיד נוגדנים לגילוי ב 4 מיקרוגרם / מ"ל
       הערה: עבור פורמט צלחת 384 באר, 12.5 μL / well של תמיסת נוגדנים משנית מוכן נדרש, ועבור פורמט צלחת 96 באר, 25 μL / well נדרש.
   12. הניחו את הצלחת על מפריד מגנטי, שטפו במהירות והפכו בכוח מעל מיכל מסוכן ביולוגי כדי להסיר נוזלים מהבארות. כאשר הצלחת עדיין הפוכה, טפחו בכוח על הצלחת כנגד ערימת נייר עבה.
   13. לשטוף כל באר עם 100 μL של חיץ Assay ולהסיר את הנוזל על ידי היפוך כוח על מיכל biohazard, כפי שתואר קודם לכן. חזור על שלבים אלה (2.1.12-2.1.13) עבור שתי כביסות בסך הכל. יש להשליך את כל ערימות הנייר המשומשות למיכל מסוכן ביולוגית.
   14. הוסף 12.5 μL של תמיסת עבודה נוגדנים משנית לכל באר של צלחת 384 באר או 25 μL לכל באר של צלחת 96 באר. מכסים את הצלחת באטם אלומיניום או בנייר כסף ודגרים במשך 30 דקות ב-RT על שייקר צלחות המכוון ל-700 סל"ד.
   15. חזור על שלבי הכביסה 2.1.12-2.1.13.
   16. הוסף 75 μL של חיץ Assay לכל באר של צלחת 384 באר או 100 μL לכל באר של צלחת 96 באר. מכסים את הצלחת באטם אלומיניום או בנייר כסף ודגרים במשך 5 דקות ב-RT על שייקר צלחות המכוון ל-700 סל"ד.
   17. נתח 60 μL באמצעות מנתח המכשירים בהתאם למדריך המערכת.

טבלה 1: סדרת דילול עבור עקומות סטנדרטיות: טבלה של גורמי דילול המשמשים לעקומות הסטנדרטיות עבור סרוטיפ IgG; מוצגת כעקומת דילול טורית של 7 נקודות, 1:5 המתחילה ב- 1 מיקרוגרם/מ"ל עבור α-Spike S1 ו- α-Nucleocapsid ו- 5 מיקרוגרם/מ"ל עבור נוגדנים α-ממברנה.

מספר סטנדרטי	סדרת דילול	אנטי-ספייק S1 או N (מיקרוגרם/מ"ל)	אנטי-ממברנה (מיקרוגרם/מ"ל)
ריק	ריק	-	-
1	STD7 1:1	1	5
2	STD6 1:5	0.2	1
3	STD5 1:25	0.04	0.2
4	STD4 1:125	0.008	0.04
5	STD3 1:625	0.0016	0.008
6	STD2 1:3125	0.00032	0.0016
7	STD1 1:15625	0.000064	0.00032

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
384-באר צד שחור פוליסטירן microtiter לוחות	תרמו פישר	12-565-346
מאגר הפעלה (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)	מוכן בבית
חיץ Assay (PBS, אלבומין 1% בסרום בקר, 0.01% פוליסורבט-20)	מוכן בבית
אלבומין בסרום בקר, חלק הלם חום	MilliporeSigma	A-7888-50G
מאגר צימוד (50 mM MES, pH 5.0)	מוכן בבית
COVID 19 M חלבון מטריצה רקומביננטי של נגיף הקורונה (6xHistag)	MyBioSource	MBS8574735
טיפים חד פעמיים פיפטה
EDC (1-אתיל-3-[3- דימתילאמינופרופיל]קרבודימיד הידרוכלוריד)	תרמו פישר	PIA35391
אלבומין עיזים, אבקת חלק V	מיליפור סיגמא	A2514-1G
IgA עז אנטי אדם, R-PE, Polyclona	תרמו פישר	OB205009
IgG עז אנטי אדם, R-PE, רב-שבטי	תרמו פישר	OB204009
IgG עז נגד ארנב, R-PE, רב-שבטי	תרמו פישר	OB403009
gM עז אנטי אדם, R-PE, רב-שבטי	תרמו פישר	OB202009
עכבר IgM אנטי-אנושי, SB 436, שיבוט SA-DA4	תרמו פישר	62999842
מנתח מכשירים	חברת לומינקס	INTELLIFLEX-RUO
צינורות מיקרוצנטריפוגות בעלי קשירה נמוכה (1.5 מ"ל)	תרמו פישר	13-698-794
מיקרוספרות MagPlex-C, אזור XXX	חברת לומינקס	MC10XXX-01
MES הידרט (2-(N-Morpholino) אתאן חומצה סולפונית הידרט)	MilliporeSigma	M2933
סרט איטום אלומיניום Microplate	תרמו פישר	07-200-683
פוליסורבט-20	תרמו פישר	BP337-500
איכות ביולוגית בע"מ PBS, pH 7.2	תרמו פישר	50-751-7328
חיץ מרווה (PBS, אלבומין 1% סרום עיזים, 0.01% פוליסורבט-20)	מוכן בבית
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) חלבון נוקלאוקפסיד (התג שלו)	Sino Biologicals	40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) חלבון ספייק (תת-יחידה S1, התג שלו)	Sino Biologicals	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) נוגדן RBD ספייק, pAb ארנב	Sino Biologicals	40592-T62
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) נוגדן נוקלאוקפסיד, ארנב mAb	Sino Biologicals	40588-R0004
SARS-CoV-2 (COVID-19) נוגדן קרום (IN), ארנב pAb	פרוסצ'י	10-516
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	תרמו פישר	PIA39269
חיץ שטיפה (PBS, 0.01% פוליסורבט-20)	מוכן בבית
מים, בדרגת LC/MS	תרמו פישר	W-64