מאמר שיטה

בדיקת פעילות פוספוליפאז: בדיקת דיפוזיה בג'ל לקביעת פעילות פוספוליפאז בתמצית ארס גולמי מ - Anthopleura dowii

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Ramírez-Carreto, S., et al., זיהוי פעילות המוליטית ופוספוליפאז בתמציות גולמיות משושנות ים על ידי בדיקות ביולוגיות פשוטות. J. Vis. Exp. (2022)

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקה לביסוס נוכחות פוספוליפאז בתמצית ארס גולמי מאנתופלורה דובי – שושנת ים ימית. הבדיקה משתמשת בטכניקת דיפוזיה של ג'ל אגרוז, שבה האנזים פוספוליפאז מפזר ומפרק פוספוליפידים המשולבים במדיה המוצקה באופן רדיאלי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אוסף אורגניזמים

  1. לאסוף שושנת ים A. dowii.
    הערה: כאן, האורגניזמים נאספו במהלך תקופות השפל באזור הגאות והשפל מול חופי אנסנדה באג'ה, קליפורניה, מקסיקו (איור 1A, B). 
  2. העבירו את האורגניזמים למעבדה במיכלים עם מי ים (איור 1C).
  3. במעבדה, נקו את האורגניזמים במים מזוקקים ביד כדי להסיר את חלקיקי המצע הגדולים הנצמדים לגוף.
  4. מיד להקפיא את האורגניזמים ב -80 ° C באולטרה מקפיא במשך 72 שעות.
  5. מניחים את האורגניזמים בכוסות מיוחדות לייבוש בהקפאה, עם תנאי ליופיליזציה של -20 מעלות צלזיוס, 0.015 psi, למשך 48 שעות.
  6. אחסנו את האורגניזמים הליופיליים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.

2. לחות רקמות

  1. לשחזר 20 גרם משקל יבש של אורגניזמים lyophilized עם 60 מ"ל (1/3 w/v) של 50 mM נתרן פוספט buffer, pH 7.5, ו 1 מעכב קוקטייל טבליה (טבלה של חומרים).
  2. במערבל מגנטי, ערבבו ברציפות את הדגימה ב~800 סל"ד, 4°C, במשך 12 שעות.

3. שחרור רעלים

  1. כדי לגרום לליזה של תאים ולפריקת נמטוציסט, יש להקפיא את הדגימה בטמפרטורה של -20°C למשך 12 שעות, ולאחר מכן להניח את המיכל במים בטמפרטורת החדר (RT) עד שהוא מפשיר עד 90%. חזור על הליך זה שלוש פעמים.
    הערה: המדגם אינו מפשיר 100%; חיוני לשמור על הדגימה ב~ 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע התפרקות חלבון.
  2. שימו לב לנמטוציסט המשוחרר תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. קח 10 μL של הדגימה על שקופית ולהניח כיסוי על זה. התבוננו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה של פי 100 ופי 60. כאן לא היה צורך בצבע.
  3. עבד את התמונות שצולמו במיקרוסקופ קונפוקלי בתוכנת ImageJ (גרסה 1.53c, וויין רסבנד, המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב, https://imagej.nih.gov/ij).
  4. אם הצינורית בתוך הנמטוציסט משתחררת ונמצאת בחוץ, הנמטוציסטים משתחררים; לאחר מכן, המשך לשלב הבא. אחרת, בצע רק מחזור אחד נוסף של הקפאה-הפשרה.
  5. כדי להבהיר את התמצית, צנטריפוגו את הדגימה ב 25,400 x גרם במשך 40 דקות, 4 מעלות צלזיוס, לשחזר את supernatant, וצנטריפוגה אותו שוב. חזור על שלב זה 3-4 פעמים.
  6. לשחזר את supernatant ולהשליך את הכדור. תמצית העל-נאטנט או הגולמית מכילה את מרכיבי הארס (רעלנים) ומולקולות תאים אחרות, כגון שומנים, פחמימות וחומצות גרעין.

4. כימות סך החלבון

  1. קבע את ריכוז החלבון של התמצית הגולמית באמצעות ערכת בדיקה צבעונית מסחרית של ברדפורד (טבלה של חומרים).
  2. לדלל את מגיב הצבע (חלק אחד של צבע עם ארבעה חלקים של מים מזוקקים).
  3. הכינו תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) חלק V (רשימת חומרים) בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל במאגר פוספט (50 מ"מ נתרן פוספט, pH 7.5).
  4. הכן את הפתרונות המפורטים בטבלה 1 במשולש.
  5. ערבבו במרץ כל תמיסה בשייקר במשך 4 שניות.
  6. לדגור על הדגימות במשך 5 דקות ב- RT, מבלי לרעוד.
  7. יש למדוד ספיגה (AU) ברזולוציה של 595 ננומטר.
  8. שרטט את ממוצעי ספיגות BSA של המדגם (AU לעומת ריכוז חלבון), וקבע את משוואת הגרף (משוואה 1).
    figure-protocol-1
    כאשר y הוא הספיגה, m הוא שיפוע הקו, x הוא ריכוז החלבון, ו-b הוא יירוט Y. כדי לחשב ריכוז תמצית גולמית, פתור עבור x באופן הבא:
    figure-protocol-2

5. קביעת מורכבות ארס פוליפפטיד

  1. הרכיבו את מיכל הזכוכית לאלקטרופורזה ג'ל אנכית בהתאם למדריך.
  2. הכן תערובת אקרילאמיד (30%): 29.2 גרם של אקרילאמיד, 0.8 גרם של ביס-אקרילאמיד, נפח סופי של 100 מ"ל. סנן את התמיסה באמצעות קרום 0.45 מיקרומטר. אחסנו את התמיסה בבקבוק כהה בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, הכינו את התערובת לג'ל הפירוק (טבלה 2).
  3. ג'ל SDS-PAGE מורכב מג'ל לפתרון וג'ל ערימה. הכינו את הג'לים בהתאם לנפחי התמיסה המוגדרים בטבלה 2. במהלך ההכנה, הקפידו לשמור על כל תערובת בטמפרטורה של 4°C כדי להפחית את זמן הפילמור.
    הערה: נפח כל תערובת משתנה בהתאם למותג הציוד המשמש; עבור פרוטוקול זה, הכרכים מתאימים להכנת ג'ל אקרילאמיד 15%, בעובי 0.75 מ"מ, עבור תא אלקטרופורזה אנכי (טבלה של חומרים).
  4. לאחר האקרילאמיד עבר פולימריזציה, ~ 10 דקות, מוסיפים את תערובת ג'ל הערימה.
  5. מכינים את התערובת לג'ל הערימה, מוסיפים אותה מיד לצלחות הזכוכית, ומניחים מסרק ליצירת הבארות לטעינת הדגימות.
  6. לאחר שג'ל הערימה עבר פולימריזציה (~ 15 דקות), הסר את המסרק והנח את מיכל הזכוכית בתא לאלקטרופורזה אנכית.
  7. יש להניח 200 מ"ל של חיץ אלקטרודות (0.25 M Tris, 0.192 M גליצין, 0.1% SDS) בתא האלקטרופורזה.
  8. ניתוח התמצית הגולמית: יש לערבב 30 מיקרוגרם של תמצית גולמית עם 5 מיקרוליטר של מאגר העמסת חלבון (25% גליצרול, 15% נתרן דודציל סולפט, 25% 2-מרקפטואתנול, 0.125 mM Tris pH 7, ברומופנול כחול 0.1 מ"ג/מ"ל) כדי לנטרל חלבונים. הנפח הסופי חייב להיות <50 μL.
  9. מחממים ב-90°C למשך 5 דקות, מצננים וצנטריפוגות למשך 3 שניות ב-1,400 x גרם. 10. טוענים את הדגימות בבארות של ג'ל הערימה. העמיס סולם משקל מולקולרי סטנדרטי.
  10. טען את הדגימות בבארות של ג'ל הערימה. העמיס סולם משקל מולקולרי סטנדרטי.
  11. הפעל אלקטרופורזה בקבוע של 25 mA למשך שעה ו- 30 דקות.
  12. הסר את מיכלי הזכוכית מתא האלקטרופורזה כדי להמשיך עם צביעת חלבוני הג'ל.

6. צביעת חלבונים

  1. שטפו את הג'ל ב-50 מ"ל מים מזוקקים כדי להסיר לכלוך מאלקטרודת החיץ.
  2. השליכו את המים.
  3. כדי למנוע דיפוזיה של חלבוני הג'ל, להוסיף את פתרון קיבוע (60 מ"ל של אתנול, 20 מ"ל של חומצה אצטית, ו 20 מ"ל של מים מזוקקים, נפח סופי 100 מ"ל). דוגרים ב-RT במשך 40 דקות עם רעידות ב-80 סל"ד. דק את הפתרון.
  4. הוסף את תמיסת הקרוסלינקינג החלבונית (15 מ"ל אתנול, 0.25 מ"ל גלוטראלדהיד, 50 מ"ל מים מזוקקים, נפח סופי 65.25 מ"ל), ודגרה במשך 30 דקות ב- RT עם טלטול ב- 80 סל"ד. הסר את הפתרון.
  5. לשטוף את הג'ל עם 100 מ"ל של מים מזוקקים במשך 5 דקות, ולהסיר את המים. חזור על הליך זה ארבע פעמים.
  6. בצע צביעת חלבון עם 50 מ"ל של תמיסה מסוננת R-250 כחול מבריק של קומאסי (40% מתנול, 10% חומצה אצטית, 50% מים מזוקקים, 0.1% צבע, נפח סופי 100 מ"ל), תוך ערבוב ב 60 סל"ד במתנד סיבובי מעבדה ב- RT במשך 15 דקות.
  7. לשחזר את הפתרון, אשר ניתן להשתמש בו כדי להכתים ג'לים אחרים.
  8. כדי לחסל את הצבע העודף, להוסיף פתרון destaining (40 מ"ל של מתנול, 10 מ"ל של חומצה אצטית, 50 מ"ל של מים מזוקקים). המשיכו לערבב (80 סל"ד) ב-RT עד שהרצועות (החלבונים המוכתמים) ידמיינו.
  9. שמור את הג'ל ב 50 מ"ל של מים מזוקקים וסרוק את התמונה במערכת תיעוד ג'ל.

7. בדיקת פוספוליפאז

  1. יש לשטוף ביצת תרנגולת אחת עם 1% SDS במים מזוקקים.
  2. מפרידים את החלמון מחלבון הביצה בתנאים סטריליים.
  3. הכן 50 מ"ל של תמיסת NaCl 0.86%, וסנן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, הכינו תמיסה A: הוסיפו 12 מ"ל חלמון ו-36 מ"ל של תמיסת NaCl 0.86%.
  4. הכינו תמיסה ב': ערבבו 300 מ"ג אגרוז ב-50 מ"ל חיץ (50 מ"מ טריס, pH 7.5), סננו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. מחממים את התמיסה במיקרוגל עד לרתיחה. מצננים במים חמים ומגיעים ל-43-45 מעלות צלזיוס.
  5. הכן פתרון C: הכן 10 mM CaCl2 וסנן אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
  6. הכן פתרון D: 10 מ"ג של רודמין 6G ב 1 מ"ל של מים מזוקקים.
  7. בתנאים סטריליים (מכסה מנוע זרימה למינרית), מוסיפים 500 מיקרוליטר של תמיסות A ו-C לתמיסה B ו-100 מיקרוליטר של תמיסה D, מערבבים ויוצקים 25 מ"ל לכל צלחת פטרי (90 x 15 מ"מ).
  8. המתן עד שהתמיסה תתמצק בתנאים סטריליים (30 דקות).
  9. הפוך בארות (~ 2-3 מ"מ קוטר) עם צינור דק.
  10. הוסף סך של 20 μL של חיץ פוספט (בקרה שלילית) בבאר אחת ו 20 μL של פוספוליפאז נחוש (בקרה חיובית) בבאר אחרת.
  11. מניחים כמויות שונות של חלבון תמצית גולמי, 5, 15, 25, 35, 45 מיקרוגרם, בבארות הנותרות, כל אחת בנפח סופי של 20 μL.
  12. המתן עד שהאגר יספח את כל הדגימות (30 דקות).
  13. לדגור ב 37 ° C במשך 20 שעות.
  14. אם נוצרת הילה סביב הבאר, הדבר מצביע על פעילות פוספוליפאז. מדוד את ההילה שנוצרה עם קליפר ורנייר.
    הערה: בצע את הניסוי במשולש (שלבים מ 7.1-7.14).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: אוסף שושנות ים. (A) אזור הגאות והשפל באל סוזאל, באחה קליפורניה נורטה, מקסיקו. (B) שושנת ים שנאספה. (C) Anthopleura dowii Verrill, 1869.

טבלה 1: כימות חלבון על ידי מבחן ברדפורד.

Tube...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיקורנינג430766
2-ברומופנול כחולסיגמאB75808
2-מרקפטואטאנולסיגמא-אולדריץ'M6250-100ML
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיותקורנינג430828
חומצה אצטית קרחוניתג'יי טי בייקר9515-03
אקרילאמידפרומגהV3115
אגרוזפרומגהV3125
ביסקרילאמידפרומגהV3143
סרום בקר אלבומין חלק VסיגמאA3059-100G
בדיקות חלבון ברדפורדביו-ראד5000006
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'C3306
צלחות תרבית תאים 96 באר, תחתית Vקורנינג3894
צנטריפוגהאפנדורף5804R
צינורות צנטריפוגותקורנינגCLS430829
מערכת ChemiDoc MPביו-ראד1708280
חומצת לימוןסיגמא-אולדריץ'251275
צלחות שטוחות שקופות.תחתונות 96 בארותתרמו סיינטיפיק3855
קומאסי כחול מבריק G-250ביו-ראד#1610406
קומאסי כחול מבריק R-250ביו-ראד1610400
דקסטרוזג'יי טי בייקר1916-01
מארז ללא תעלותלבקונקואנכיhttps://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
ג'ל דוק EZביו ראד.מערכת תיעוד ג'ל
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516-4L
המוציטומטרמרינפלד650030
ImageJ (תוכנה)NIH, ארצות הבריתגירסה 1.53c
אינקובטור 211לאבנטI5211 DS
מתנולג'יי טי בייקר9049-03
תא טטרה מיני-פרוטיאניביו-ראד1658000EDU
Na2HPO4ג'יי טי בייקר3824-01
NaClג'יי טי בייקר3624-01
NaH2PO4.H2Oג'יי טי בייקר3818-05
תוכנת מקורגרסה 9כדי לעצב את העלילה עם התאמות סיגמואידליות
פטרידישבז351007
ערכת PipetmanגילסוןF167380
מיני ג'ל PrecastBioRad1658004
סולם חלבונים לשימורתרמו סיינטיפיק26620
קוקטייל מעכב פרוטאזרוש11836153001
חלבון Assay צבע מגיב להתרכזביו-ראד5000006
רודאמין 6Gסיגמא-אולדריץ'252433
SDSסיגמא-אולדריץ'L4509
נתרן ציטראט דיהידראטג'יי.טי בייקר3646-01
ספקטרופוטומטרתרמו סיינטיפיקG10S UV-VIS
בסיס טריססיגמא-אולדריץ'77-86-1
ספק כוח וולטהופרPS300B

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים