בדיקת כיראליות תא בצורת טבעת בצורת טבעת: טכניקת מבחנה לקביעת כיראליות רב-תאית בהתבסס על יישור תאים על מיקרו-תבניות בצורת טבעת

תקציר

מקור: Zhang, H. et al. A Micropatterning Assay for Measurement Cell Chirality. J. Vis. Exp. (2022)

בסרטון זה, אנו מתארים בדיקת כיראליות של תאים כדי לקבוע את הטיית היישור של תאים בגבול גיאומטרי מוגבל כגון מיקרו-תבנית טבעתית. כיראליות היא תכונה אינהרנטית של רוב סוגי התאים והיא נקבעת על ידי גורמים גנטיים וסביבתיים. הכרת הכיראליות של אוכלוסיית תאים נורמלית יכולה לעזור לסנן תאים שטופלו בתרופות.

פרוטוקול

1. ייצור בולי פולידימתילסילוקסאן (PDMS)

1. צייר מערך של טבעות בקנה מידה זעיר באמצעות תוכנת CAD, עם קוטר פנימי של 250 מיקרומטר וקוטר חיצוני של 450 מיקרומטר. התבנית המשמשת בפרוטוקול זה היא מערך של 10 x 10 עם מרחק של 850 מיקרומטר בין הטבעות.
2. הדפיסו מסיכת שקיפות של דוגמת המילוי ברזולוציה הרצויה באמצעות שירות הדפסת מסיכות של חברת מיקרו-פבריקציה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: הממדים שסופקו של הטבעת הוכחו כעובדים עבור סוגי תאים רבים.
3. בצע פוטוליתוגרפיה אולטרה סגולה (UV) באמצעות המסכה המכילה את התכונות הרצויות כדי ליצור תבנית פוטו-התנגדות שלילית (כגון SU-8).
   1. כסו פרוסת סיליקון מצופה בהתנגדות לאור על ידי מסיכת השקיפות המיוצרת בשלבים 1.1-1.2.
   2. על יישור מגע UV, פילמרי photoresist תחת אזורים שקופים של המסכה על ידי אור UV.
      הערה: לאחר שטיפה נוספת ופיתוח, תבנית האב עם התכונות הרצויות הוא מיוצר. הפרטים התפעוליים תלויים בציוד הספציפי בו נעשה שימוש.
4. הכינו פרה-פולימרים אלסטומריים PDMS על ידי ערבוב עם חומר הריפוי שלו ביחס של 10:1 ולאחר מכן יצקו את התערובת על התבנית בצלחת פטרי.
5. מניחים את התבנית בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר ב-PDMS ואופים בתנור בטמפרטורה של 60°C למשך שעתיים לפחות.
6. לאחר ריפוי מלא של PDMS, לחתוך את מערכי דפוס חותמות.
   הערה: חותמות עבות יותר (כ-1 ס"מ) עשויות להיות מועדפות בשל קלות הטיפול בשלבים מאוחרים יותר של הדפסת מיקרו-מגע.

2. ציפוי שקופיות זכוכית

1. נקו את מגלשות הזכוכית. השרו את המגלשות באמבט אתנול 100%, הסוניק למשך 5 דקות ולאחר מכן שטפו במים.
2. חזור על שלב זה תחילה עם אצטון, לאחר מכן עם איזופרופנול, ולאחר מכן ייבוש בזרם חנקן.
3. השתמש בציוד אידוי של קרן אלקטרונים (E-beam) כדי לצפות שכבות טיטניום וזהב על שקופיות זכוכית.
   הערה: עבור שכבת טיטניום, העובי הרצוי הוא 15 Å (1 Å = 10-10 מ '). עבור שכבת הזהב, העובי הרצוי הוא 150 Å. מצפים תחילה טיטניום ולאחר מכן זהב, שכן שכבת הטיטניום משמשת כדבק בין הזהב למגלשת הזכוכית.
4. הכניסו את המגלשות המנוקות לתא האידוי והכניסו כורי היתוך מזהב וטיטניום מתחת לתריסים.
5. יש לשאוב במורד התא כדי ליצור ואקום נמוך מ-10-5 Pa לפני התכת מתכות. מקדו את קרן האלקטרונים על המתכת וכווננו את ההספק כך שקצב ההפקדה יתאים לשליטה בעובי התצהיר.
6. פתח את התריס כדי להתחיל את שקיעת המתכת. סגור את התריס כאשר מגיעים לעובי הרצוי.
7. החליפו כורי היתוך בין אידוי רציף של שתי מתכות.
8. המתינו עד שכורי ההיתוך יתקררו כנדרש על ידי הציוד, אווררו את התא והוציאו החוצה את מגלשות הזכוכית מצופות הזהב.
9. שאבו שוב את התא לצורך תחזוקת ציוד.
   הערה: הפרטים התפעוליים עשויים להיות תלויים במאייד E-beam ספציפי. לאחר מבוקר היטב, שיעור הפקדה נמוך של טיטניום חשוב. שכבת טיטניום עבה מובילה לעתים קרובות לראות לקויה, במיוחד עבור הדמיה פלואורסצנטית של התאים. לאחר הציפוי, ניתן לאחסן את מגלשות הזכוכית מצופות הטיטניום/זהב בתא ואקום יבש בטמפרטורת החדר למשך חודש אחד לפחות.

3. הדפסת מיקרו-מגע

1. חותכים את המגלשה המצופה טיטניום/זהב לחתיכות קטנות יותר, אם רוצים. צורה ריבועית של 12 מ"מ x 12 מ"מ מומלצת ליישום טיפוסי (איור 1B).
2. השתמשו בחותך זכוכית כדי להחליק על פני השטח כדי להשאיר מסילה משוננת, ואז החזיקו את מגלשת הזכוכית משני הצדדים והתכופפו על השקע כדי לשבור לרבעים קטנים. יש להימנע מלגעת במשטח המצופה בזהב.
   הערה: כדי לקבוע חזותית איזה צד של הזכוכית הוא המשטח המצופה במקרה של התהפכות בשוגג, השווה את השתקפות האור משני הצדדים. המשטח המצופה זהב יראה השתקפות בהירה יותר, ואילו הצד שאינו מצופה יהיה בעל השתקפות עמומה יותר (משכבת הטיטניום בצד השני של הזכוכית). דרך חלופית היא להתבונן בשולי המגלשה, וניתן לקבוע את צד הציפוי ממשטח החיתוך האנכי.
3. נקו את המגלשות על ידי השריית אתנול 100% בצלוחית פטרי כאשר צד הזהב כלפי מעלה על שייקר אורביטלי למשך 10 דקות לפחות. שאפו החוצה את האתנול, ואז יבשו כל מגלשה על ידי נשיפה עם זרם חנקן.
4. נקו את חותמות ה-PDMS במי סבון ולאחר מכן באתנול 100%. יבש את הבולים עם גז חנקן.
5. הכן תמיסת 2 mM octadecanethiol (C18) על ידי המסת 5.74 מ"ג של אבקת C18 ב 10 מ"ל של 100% אתנול.
   הערה: יש לאטום ולאחסן את תמיסת C18 בטמפרטורת החדר. הדפסת תבניות עם C18 יוצרת מונושכבה דבק בהרכבה עצמית שאליו עדיף לצרף את הפיברונקטין והתאים.
6. השרו את חותמות ה-PDMS בתמיסת C18 כאשר המשטח המעוצב פונה כלפי מטה למשך 10 שניות וייבשו בעדינות עם גז חנקן למשך 60 s.
   הערה: בעת הייבוש, מניחים תחילה את הזרם הרחק מהבול (כ-1 מ') עד שרוב הנוזלים מתאדים ולאחר מכן מקרבים את הזרם לאט לייבוש מלא של הבול. זאת כדי למנוע פיצוץ של תמיסת C18 במקום להתייבש על הבול.
7. הניחו את הבול עם הפנים כלפי מטה על מגלשות הזהב למשך 60 שניות לפני ההסרה.
8. כדי להבטיח הטבעה נכונה, טפחו בעדינות על הפינצטה על הבולים כדי להעביר את הדוגמאות כראוי. אל תדחפו למטה חזק מדי, ומשקל הפינצטה בדרך כלל מספיק.
   הערה: בדיקה ויזואלית של הבול במהלך ההקשה תוודא שהבול ושקופית הזכוכית יצרו מגע אחיד.
9. הכינו תאי לחות.
   1. פיפטה 1 מ"ל של אתנול 70% לתוך מכסה צלחת פטרי הפוך ולהניח חתיכת פרפילם כדי לכסות את פני השטח (מכוסה עם הפנים כלפי מעלה).
   2. השתמשו בפינצטה כדי להרים, הניחו פרפילם כדי להבטיח שאין בועות אוויר, והסירו עודפי אתנול במידת הצורך.
10. הכן 2 mM HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) פתרון: לדלל 5 μL תמיסת מלאי ב 5 מ"ל של 100% אתנול.
    הערה: ניתן לאטום ולאחסן את תמיסת EG3 המדוללת ב- 4 מעלות צלזיוס, ומלאי EG3 לא מדולל יש לאחסן ב- -20 מעלות צלזיוס. הטיפול ב-EG3 משמש ליצירת אזור הזכוכית ללא C18 שאינו נדבק לתאים.
11. מיקרופיפטה 40 μL טיפות של EG3 עבור כל רבע זכוכית מחליקות על הפרפילם בתא הלחות, ומשאירות מספיק מקום בין הטיפות כדי להסביר את המרווח של שקופיות הזהב.
12. השתמש בפינצטה כדי להניח שקופיות זהב מודפסות C18 עם הפנים כלפי מטה על הטיפות ולהבטיח שאין בועות מתחת לשקופיות. דחפו בעדינות את המגלשות זו לזו מבלי להרים אותן כדי למזער את האידוי.
    הערה: מניחים קצה אחד של הזכוכית מחליק למטה ליד הטיפה, ואז מורידים לאט לאט את הקצה השני של הזכוכית מחליקים למטה. אם קיימת בועה, דחפו את מגלשת הזהב מבלי להרים אותה עד שהבועה כבר לא תהיה נוכחת.
13. אטמו היטב את צלחת הפטרי עם פרפילם והשאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות < לפחות > הערה: אם רוצים דגירה נרחבת, אוטמים פעמיים את צלחת הפטרי ומשאירים אותה עד 24 שעות.
14. בארון בטיחות ביולוגית, הניחו שקופיות זהב עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי, השרו ושטפו 3 פעמים באתנול 70% כדי להסיר EG3, ואז השאירו אתנול למשך 10 דקות לעיקור.
15. שאפו את האתנול והחליפו אותו ב-PBS סטרילי.
16. הכינו תא לחות אחר כמתואר בשלב 3.9, עם PBS במקום אתנול.
    הערה: בשל ההבדל במתח פני השטח, קל יותר להוסיף תחילה 4-5 מ"ל של PBS להניח פרפילם ולהסיר בועות, ולאחר מכן לשאוף את העודף.
17. הכינו את תמיסת הפיברונקטין 50 מיקרוגרם/מ"ל (חלבונים אחרים, אם תרצו) ב-PBS סטרילי ומיקרופיפטה 50 מיקרוליטר טיפות של תמיסת פיברונקטין לכל רבע מחליקות על הפרפילם, ומשאירות רווח בין טיפות.
    הערה: ציפוי פיברונקטין מאפשר היצמדות תאים למשטחים בעלי דוגמאות.
18. השתמשו בפינצטה כדי להניח שקופיות עם הפנים כלפי מטה על הטיפות ולוודא שאין בועות מתחת למגלשות. דחפו בעדינות את המגלשות זו לזו מבלי להרים אותן.
    הערה: פינצטה מזכוכית או פינצטה רקיק עם קצוות ישרים ורחבים מומלצים לטיפול בשקופיות.
19. השאירו את צלחת הפטרי בארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות.
20. לאחר 30 דקות, הניחו את מגלשות הזהב עם הפנים כלפי מעלה ב-PBS לאחר שטיפה במשך 3 פעמים.
    הערה: שקופיות בדוגמת פיברונקטין ניתן לאחסן PBS ב 4 ° C במשך כחודש.

4. זריעת תאים לשקופיות עם מיקרו-תבניות

1. חממו את תרבית התאים ואת הטריפסין באמבט מים של 37°C.
   הערה: התיאור הבא של תת-תרבית הוא עבור תאי NIH/3T3. תנאי התרבית עשויים להשתנות בהתאם לסוגי התאים.
2. (אופציונלי) השרו שקופיות בדוגמת תרבית בצלחת בעלת 12 בארות, התחממו עד 37°C באינקובטור לפני טריפסיניזציה של תאים לחיבור תאים טוב יותר.
3. טריפסיניזציה של התאים, נטרול עם מדיה המכילה FBS, צנטריפוגה למטה ב 100 x גרם במשך 3 דקות, ולאחר מכן resuspend על ידי ערבוב היטב עם מדיה טרייה.
   הערה: ודא שהתאים מנותקים לחלוטין זה מזה.
4. ספרו את התאים, דיללו ל-200,000 תאים/מ"ל והוסיפו 0.5 מ"ל מתרחיף התא לכל באר המכילה מגלשת זהב אחת.
5. נערו בעדינות את צלחת הבאר מספר פעמים לזריעת תאים אחידה ואחסנו אותה באינקובטור למשך 15 דקות כדי לאפשר חיבור תאים.
6. לאחר 15 דקות, בדוק את חיבור התא תחת מיקרוסקופ. אפשר זמן נוסף, במידת הצורך.
   הערה: התאים המחוברים יתפשטו על פני השטח עם פילופודיום גלוי או שיטוח ולא יזוזו מהמשטח כאשר לוחית הבאר נוקשה או מזיזה בעדינות.
7. שואפים החוצה את המדיה המכילה תאים לא מחוברים מכל באר ומוסיפים 1 מ"ל של מדיה תרבית. לטיפול תרופתי, יש להוסיף ריאגנטים נוספים למדיה התרבית בשלב זה.
8. תרבית את התאים באינקובטור במשך 24 שעות ובדוק את המפגש כדי לקבוע אם נוצרה כיראליות.
   הערה: מפגש מעל 75% מומלץ לרוב סוגי התאים, ומפגש יתר עלול להשפיע על אפיון הכיראליות.

5. אוסף תמונות

1. תקן את התאים בעת מפגש.
   1. הסר את חומרי התרבות מצלחת הבאר ושטוף פעם אחת עם PBS.
   2. יש להוסיף תמיסת פרפורמלדהיד 4%, לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם PBS.
      הערה: אם הקיבוע משנה באופן משמעותי את המורפולוגיה של התא, מומלץ לבצע הדמיה לפני הקיבוע
2. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם פונקציונליות מצלמה, צלם כל טבעת בשקופיות ברזולוציה גבוהה (עדשת אובייקט 10x מספיקה לניתוח).

6. אפיון כיראליות התא (איור 2)

1. הורד קבצי קוד MATLAB לאפיון כיראליות.
2. הוסף את תיקיית הקוד ותיקיות המשנה (עם ארגז כלים של סטטיסטיקה מעגלית בפנים) לנתיב MATLAB ופתח את הקובץ "ROI_selection.m". בשורה 4, שנה את הספרייה לתיקיית הנתונים הרצויה (עבור משתמשי חלון, החלף "/" ל- "\" בשורות 4 ו- 5).
3. שנה את גודל התמונה בשורה 14, כאשר שתי הדמויות הראשונות מייצגות את גודל העיגול הפנימי של הטבעת ואילו השתיים האחרות מייצגות את החיצוני.
   הערה: ודאו שהגדלים של כל התמונות בתיקייה לניתוח זהים.
4. לחץ על כפתור הפעלה כדי להפעיל את קוד MATLAB "ROI_selection.m" כדי לקבוע את אזור העניין (ROI) בתמונות עם ניגודיות פאזה.
5. גררו ידנית את ריבוע הבחירה כך שיתאים לטבעת, ולאחר מכן לחצו פעמיים על התמונה כדי לאשר את הבחירה.
6. חזור על שלב זה עבור כל תמונה בתיקייה (התמונה הבאה תופיע באופן אוטומטי לאחר אישור בחירת החזר ההשקעה של תמונה קודמת); קובץ ".mat" יופק כדי לאחסן את פרטי החזר ההשקעה עבור כל תמונה.
7. פתח את הקובץ "Analysis_batch.m" ושנה את ספריית התיקיה זהה לשלב 6.2. (עבור משתמשי חלונות, לשימוש בפעם הראשונה, החלף את "/" ל- "\" בשורות 5, 6, 124 ו- 130)
8. לחץ על כפתור הפעלה כדי לבצע את הקוד "Analysis_batch.m" כדי לקבוע את הכיראליות של דפוסי טבעת סלולרית מרובים. יופק קובץ "datatoexcel.txt", המכיל סטטיסטיקה מעגלית עבור כל טבעת וכן את מספרי הטבעות בכיוון השעון, הלא-כיראליות והאנטי-בכיוון השעון.

תוצאות

איור 1. סכמטי של micropatterning הסלולר. (A) הליך של מיקרו-פבריקציה והדפסת מיקרו-מגע לתבניות תאים. תבנית photoresist שלילית נעשתה על ידי crosslinking אולטרה סגול (UV) של photoresist באמצעות מסכה המכילה תכונות micropatterning (1-2). פולידימתילסילוקסאן (PDMS) פרה-פולימרים אלסטומריים נוצקו על התבנית ליצירת חותמות (3-4). לאחר מכן, מונושכבה להרכבה עצמית (SAM), אוקטה-דקנתיול (C18), צופתה ע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אתנול 200 הוכחה	קופטק	DSP-MD-43
מערכת מיקרוסקופ BZX	קיינס	BZX-600
מדיום עיט מעובד של דולבקו (DMEM), גלוקוז גבוה	גיבקו	11965092
מאייד קרן אלקטרונים	טמסקל	BJD-1800	ציפוי סרט זהב-טיטנום
סרום בקר עוברי	VWR	89510-186
פיברונקטין מפלזמה של בקר	סיגמא	F1141-5MG
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית	VWR	10024-048
פינצטה מזכוכית	אקסלטה	390BSAPI
כדורי אידוי זהב	חומרים מתקדמים בינלאומיים	₪18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	פרוכימיה	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	עבודות מתמטיות	MATLAB_R2020b
תאי NIH/3T3	ATCC	CRL-1658
OAI צור קשר עם היישור	OAI	200	פוטוליתוגרפיה UV
אוקטדקנתיול (C18)	סיגמא	O1858-25ML
שייקר אורביטלי	VWR	89032-088
מלח חוצץ פוספט (PBS)	מוצר מחקר בינלאומי	P32080-100T
פולידימתילסילוקסאן סילגארד 184	דאו קורנינג	DC4019862
פרוסת סיליקון	וופל אוניברסיטאי	ID#809
נתרן פירובט	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	מיקרוכם	Y311075 0500L1GL
כדורי אידוי טיטניום	חומרים מתקדמים בינלאומיים	TI14
מסיכת שקיפות (עם תכונה)	Outputicity.com	לא ישים	שירות הדפסת מסכות
טריפסין-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072