בדיקת ספיגת שלפוחית חוץ-תאית: שיטה לדמיין ולכמת ספיגה תאית של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות טכניקת הדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית

Abstract

מקור: Kim, C. J., et al., Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (2022).

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה כדי לדמיין ולכמת את הספיגה התאית של שלפוחיות חוץ-תאיות או EVs. בדיקה זו עושה שימוש בהדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ומאפשרת להבחין בין כלי רכב חשמליים מופנמים לבין רכבים חשמליים המודבקים לפני השטח של התא.

Protocol

1. בידוד EV ותיוג EV חיסוני-פלואורסצנטי על שבב

1. איסוף מדיה של תרביות תאים (CCM) ועיבוד מקדים של CCM לבידוד EV
   1. זרע תאי PC3 במפגש של 30% בצלוחית תרבית^{תאים בגודל} 75 ס"מ. אפשר לתאי הבקרה לגדול למפגש של 90% (~ 48 שעות) במדיה סטנדרטית ובתוספים ספציפיים לקו התא.
      הערה: כדי למנוע מרכיבים המכילים EV להשפיע על ספיגת התאים (כלומר, נסיוב בקר עוברי), השתמשו במדיה ובתוספים דלילי אקסוזום.
   2. קצור את CCM.
   3. צנטריפוגו את ה-CCM במהירות של 1000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לשלשל תאים לא מחוברים ופסולת גדולה שנקטפה עם המדיה. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי חדש.
   4. בצינור החדש, צנטריפוגה את הסופרנאטנט במהירות של 10,000 x גרם למשך 20 דקות ב -4 מעלות צלזיוס כדי לפלוט פסולת קטנה יותר וגופים אפופטוטיים שנותרו במדיה. חלק מכלי הרכב החשמליים הגדולים יותר ייפלטו. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש.
   5. סנן את הסופרנאטנט דרך מזרק הידרופילי פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) 0.45 מיקרומטר מסנן ממברנה.
      הערה: אם לא מעבדים מיד CCM לבידוד EV, אחסנו את CCM המעובד מראש בטמפרטורה של -80°C עד לביצוע הבידוד. במקרה של הקפאה, הגבילו את מחזורי ההקפאה-הפשרה למחזור אחד.
2. בידוד EV מ-CCM באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון
   1. אם קפואים, הפשירו לחלוטין CCM ומערבולות במשך 30 שניות לפני שלב 1.2.2.
   2. הזריקו 1 מ"ל של CCM מעובד מראש (שלב 1.1) לתוך תא הדגימה של התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון (ראה טבלת חומרים).
      הערה: בצע את הליך ההפעלה הסטנדרטי עבור התקן מיקרופלואיד מבוסס ננו-סינון.
   3. סחרור במהירות 3000 סל"ד במשך 10 דקות במכונת הספינינג העליונה (ראה טבלת חומרים) כדי להפעיל את ההתקן המיקרופלואידי.
      הערה: אם CCM נשאר בתא הדגימה לאחר ההפעלה הראשונית, בצע סיבובים נוספים עד שכל CCM יתרוקן מתא הדגימה.
   4. הסר את הנוזל מתא הפסולת על ידי צנרת וחזור על שלבים 1.2.1, 1.2.2 ו- 1.2.3 פעמיים.
      הערה: בסך הכל, 3 מ"ל של CCM יעובדו לבידוד EV.
   5. הזריקו 1 מ"ל מלח חוצץ פוספט (PBS) לתוך תא הדגימה כדי לשטוף את כלי הרכב החשמליים המבודדים. ספין במכונת הטווייה העליונה להפעלת המכשיר המיקרופלואידי כאמור בשלב 1.2.3. אתר את כלי הרכב החשמליים הטהורים בממברנה של המכשיר.
      הערה: איכות כלי הרכב החשמליים שבודדו מהתקן מיקרופלואיד מבוסס ננו-סינון, באופן ספציפי, אושרה והושוותה לשיטת UC הקונבנציונלית על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA), מיקרוסקופ תאורה מובנה, בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים ו-PCR בזמן אמת במחקר הקודם.
3. תיוג אימונופלואורסצנטי של EV באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון (איור 1)
   1. בחר נוגדן ספציפי לרכב חשמלי בהתאם למטרת הבדיקה (ראה טבלת חומרים).
      הערה: נוגדנים מסוימים עלולים להפריע לאתרי קשירת ליגנדים ספציפיים למסלולי ספיגת EV (כלומר, אנדוציטוזה).
   2. יש להזריק 1 מיקרוגרם/מ"ל של הנוגדן הספציפי ל-EV לתוך חור ה-elution של המכשיר המכיל 100 μL של כלי רכב חשמליים מבודדים.
   3. יש לדגור במשך שעה אחת בחושך ב-RT על שייקר הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של הנוגדן על פני הדגימה.
   4. הצמידו סרט הדבקה לחור ההדבקה. הזריקו 1 מ"ל PBS לתא הדגימה כדי לשטוף את שאריות הנוגדנים.
   5. סובב את ההתקן במהירות 3000 סל"ד עד שתא הדגימה יתרוקן. הסר כל נוזל מתא האשפה על ידי צנרת. הזריקו 1 מ"ל PBS לתא הדגימה.
      הערה: כלי רכב חשמליים בעלי תווית פלואורסצנטית ימוקמו בתא הממברנה.
   6. פיפטה של כלי רכב חשמליים המסומנים באופן פלואורסצנטי (איור 2) מתא הממברנה לצינור ענבר. יש לחסום מאור עד לשימוש.

2. דגירה של תאים עם סימון פלואורסצנטי של כלי רכב חשמליים לבדיקת ספיגת EV

1. זריעת תאי יעד ותרבית על צלחות תואמות תרבית תאים.
   1. זרע 1 x 10⁴ תאי PC3 לתוך צלחת microslide 8-well (9.4 x 10.7 מ"מ עבור כל באר) עם 0.2 מ"ל של מדיה או 4 x 10⁴ תאי PC3 לתוך צלחת 35 מ"מ עם 1 מ"ל של מדיה. לוחצים את התאים לצלחת תואמת תרבית תאים המורכבת מכיסוי דק (עובי: 0.18 מ"מ).
      הערה: הכיסוי הדק ממזער את הפיזור השלילי של האור.
   2. אפשרו לתאים להיצמד למשך הלילה בתנאי תרבית תאים אופטימליים (37°C, ריכוז_CO2 5%, 90% לחות).
   3. יש לשטוף תאים שהודבקו פעמיים באמצעות מדיה מדולדלת אקסוזום (המתוארת בשלב 1.1.1).
2. דגירה של תאים עם כלי רכב חשמליים בעלי תווית פלואורסצנטית.
   1. מדוד את הריכוז של כלי רכב חשמליים המסומנים באופן פלואורסצנטי (שלב 1.3.5) על-ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA, איור 3). לקבוע את הריכוז האופטימלי של כלי רכב חשמליים המסומנים פלואורסצנטית שיש להוסיף לתאים בתרבית (שלב 2.1.2).
   2. דללו את כלי הרכב החשמליים המסומנים באופן פלואורסצנטי במדיה מדולדלת אקסוזום כדי להתאים לריכוז הרצוי שנמדד בשלב 2.2.1. (כלומר, 7.80 x 10⁹ כלי רכב חשמליים (בערך נת"ע) ב-200 מיקרוליטר של מדיה מדולדלת אקסוזומים.)
   3. הוסף את כלי הרכב החשמליים המדוללים (שלב 2.2.2) לתאי המטרה המודבקים שהוכנו ב-2.1.2. דגירה לזמן ניסוי (כלומר, 4, 8 או 12 שעות).
   4. שטפו תאים שלוש פעמים במדיה נטולת אקסוזום כדי להסיר EVs.
      שאינם מופנמים הערה: אופציונלי: ניתן לקבע תאים לאחר שטיפה.
   5. יש לתייג את הציטופלסמה של התאים המודבקים ב-1 מיקרוגרם/מ"ל של CMTMR ((5-(ו-6)-((4-כלורומתיל (בנזואיל)אמינו) טטרמתילרודמין) (ראו טבלת חומרים) ולדגור בתנאים אופטימליים של תרבית תאים (37°C, ריכוז CO₂ 5%, 90% לחות).
      הערה: צבעי אזור התא צריכים להיות פלואורסטיים בנפרד מכלי רכב חשמליים מסומנים כדי לסייע בקביעת המיקום המרחבי (מופנם או שטחי) של כלי הרכב החשמליים שעברו זינוק במהלך בדיקת ספיגת הרכב החשמלי.
   6. יש לשטוף את התאים המסומנים פעמיים במדיה מרוקנת אקסוזום כדי להסיר את שאריות הצבע. הוסף מדיה טרייה מדולדלת אקסוזום לתאים כהכנה לדימות קונפוקלי של תאים חיים.

3. מיקרוסקופ קונפוקלי

1. כדי לבצע הדמיה של תאים חיים, השתמש באינקובטור על הבמה כדי לשמור על תנאי תרבית תאים אופטימליים (37 ° C, ריכוז 5% CO₂, 90% לחות).
2. מניחים את התאים המוכנים באינקובטור על הבמה.
3. הגדר את פרמטרי ההדמיה בהתבסס על דגימות בקרה.
   הערה: דגימות הבקרה המוצעות כוללות: כלי רכב חשמליים המסומנים באופן פלואורסצנטי בלבד, תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי, כלי רכב חשמליים ללא תווית ותאים ללא תווית.
4. קבע את עומק תאי היעד ואת טווח גודל הערימה בכיוון z כדי לקבל תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות.
   הערה: העובי של ערימת Z הוא 1 מיקרומטר. רכישת התמונה התלת-ממדית הקונפוקלית נמשכה 2 דקות ו-34 שניות (כל רכישת תמונה במישור Z ארכה כ-8 שניות; בסך הכל עשרים תמונות מחסנית Z).
5. הגדירו את רכישת התמונה לתמונות מרובות בערימת z של צבע ספציפי לתא (כלומר, אדום) וצבע ספציפי לרכב חשמלי (כלומר, ירוק) בו-זמנית (איור 4 ואיור 5A).

4. עיבוד תמונה

1. השתמש בתוכנה אוטומטית לעיבוד תמונה כדי לנתח את התמונות הקונפוקליות הגולמיות בערימת z ולקבוע את ספיגת הרכב החשמלי לפי תאים (ראה טבלת חומרים).
2. הגדר פרמטרי סף לאות הפלואורסצנטי של התאים ולצבעים ספציפיים לרכב חשמלי. בנו את המשטחים הווירטואליים של התאים (איור 5A,B).
   1. כדי לבנות את המשטחים הווירטואליים של תאים, לחץ על הלחצן הוסף משטחים חדשים.
   2. בחר חישוב המרחק הקצר ביותר כ"הגדרות אלגוריתם" כדי להשתמש באלגוריתם שסופק על-ידי התוכנה ולאחר מכן לחץ על הבא: ערוץ מקור.
   3. בחר ערוץ 2 - CMTMR כ"ערוץ מקור" בניסוי זה.
   4. בחר Smooth והכנס את הערך המתאים ל- "Surfaces Detail" להחלקת משטחים.
      הערה: 0.57 מיקרומטר בניסוי זה מאחר שפיקסל אחד מייצג 0.57 מיקרומטר בנתוני הדמיה גולמיים.
   5. בחר עוצמה מוחלטת בתור "סף".
   6. לסף אוטומטי של התמונה הפלואורסצנטית באמצעות האלגוריתם שסופק, לחצו על 'סף' (עוצמה מוחלטת): הערך נקבע אוטומטית.
   7. בחר הפעל כ"פיצול עצמים נוגעים (אזור גדל)" והכנס את הערך של גודל התא המשוער ל"קוטר נקודות זרע", 10.0 מיקרומטר בניסוי זה. לאחר מכן לחץ על הבא: סינון נקודות זרע.
   8. כדי להגדיר את משטחי התא הווירטואליים, לחץ על + לחצן הוסף ולאחר מכן בחר איכות כ"סוג סינון". סף את הערך המתאים (210 בניסוי זה) עבור הגבול הנמוך על-ידי בדיקה חזותית ואת הערך המרבי (1485) עבור הגבול העליון, ולאחר מכן לחץ על לחצן סיום.
      הערה: בדיקה חזותית פירושה שחוקר יכול להבחין בין האזור התאי לבין תמונת פלורסנט גולמית.
   9. לאחר מכן, כדי לבנות את הנקודות הווירטואליות של כלי רכב חשמליים, לחץ על הלחצן הוסף נקודות חדשות.
   10. בחר גדלי ספוט שונים (הגדלת אזור) וחישוב המרחק הקצר ביותר כ"הגדרות אלגוריתם" ולאחר מכן לחץ על הבא: ערוץ מקור.
   11. בחר ערוץ 1 - Alexa Fluor 488 כ"ערוץ מקור" בניסוי זה.
   12. הכנס את הערך המתאים ל"קוטר XY משוער" לזיהוי נקודתי, 1 מיקרומטר בניסוי זה. לאחר מכן, לחץ על הבא: סינון כתמים.
   13. כדי להגדיר את נקודות ה-EV הווירטואליות, לחץ על כפתור + הוסף, בחר איכות כ"סוג סינון" והגדר "סף תחתון" על ידי בדיקה חזותית, 100 בניסוי זה. לאחר מכן, לחצו על הלחצן הבא: סוג אזור ספוט.
   14. בחרו 'עוצמה מוחלטת' בתור 'סוג אזורי ספוט' ולאחר מכן לחצו על 'הבא: אזורי ספוט'.
   15. כדי לסף, האזור של נקודות EV, הכנס את הערך המתאים ל"סף אזור" על ידי בדיקה חזותית, 100 כ"סף אזור" בניסוי זה.
       הערה: בדיקה חזותית פירושה שחוקר יכול להבחין בין אזור הרכב החשמלי לבין תמונת פלורסנט גולמית.
   16. בחר/י ״אמצעי אחסון באזור״ כ״קוטר מ״ ולאחר מכן לחץ/י על ״סיום״.
3. השתמשו באלגוריתמים שסופקו על ידי התוכנה כדי לפצל את הנקודות המקובצות בתוך המשטח הבנוי בשלב 4.2 (איור 5C, i-iv).
   1. לחץ/י על הנקודות המובנות ועבור/י אל ״מסננים״.
   2. לחץ/י על הכפתור + הוסף, ואז בחר/י ״המרחק הקצר ביותר למשטחים״ משטחים = משטח 1 כ״סוג מסנן״, ואז לחץ/י על הכפתור ״שכפל בחירה למשטחים״ חדש. הסף הנמוך ביותר (-7.0 בניסוי זה) עבור הגבול הנמוך והערך המתאים (-0.5) עבור הגבול העליון.
      הערה: הגדר את הגבול העליון עם הרדיוס המשוער של כתמים. בניסוי זה, הקוטר המשוער של כתמים, כלומר נקודות EV, הוגדר ל -1 מיקרומטר בשלב 4.2.11.; לכן, הגבול העליון יכול להיות 0.5.
4. ספירה אוטומטית של כלי רכב חשמליים בתוך התאים
   הערה: התוכנה תספור באופן אוטומטי את מספר כלי הרכב החשמליים בתוך התאים, ותציין את המספר שהופנם על ידי תאי היעד.
   1. לחץ על הבחירה הבנויה 'כתמים 1' [המרחק הקצר ביותר למשטחים: משטחים = משטחים 1, בין -7.00 ל- -0.500].
   2. עבור אל סטטיסטיקה, וייצא את הערך מ "מספר כולל של כתמים"
      הערה: האלגוריתמים המסופקים על ידי התוכנה יחשבו באופן אוטומטי את מספר התאים ונפחם.
5. קבע את התפוקה של ספיגת רכב חשמלי לכל תקופת דגירה בהתבסס על הערכים המחושבים לעיל (איור 6).
   1. כדי להשיג את מספר התאים, לחץ על המשטחים הבנויים 1 ולאחר מכן עבור אל סטטיסטיקה וייצא את הערך של "מספר כולל של משטחים" מתוך כולל.
   2. עבור אל מפורט לסטטיסטיקה כדי לייצא את אמצעי האחסון ממפורט.

Results

איור 1: המחשה סכמטית של בידוד EV ותיוג על שבב באמצעות התקן מיקרופלואיד מבוסס ננו-סינון. (A) בידוד כלי רכב חשמליים מ-CCM. (B) תיוג אימונופלואורסצנטי על שבב של כלי רכב חשמליים. (C) הסרת נוגדנים לא קשורים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 נוגדן CD63 אנטי אנושי	ביואגדה	353038	צבע פלואורסצנטי מצומד נוגדן ספציפי ל-EV
CellTracker צבע CMTMR כתום	תרמו פישר סיינטיפיק	C2927	מגיב תיוג פלואורסנטי של תאים חיים (ציטופלסמה)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	ניקון	MRD77400	מטרה לדימות קונפוקלי, NA=1.25
תוכנית CFI Apo VC 20X	ניקון	MRD70200	מטרה לדימות קונפוקלי, NA=0.75
אקסודיסק	Labspinner Inc.	EX-D1001	התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון לבידוד EV
אקסודיסקברי	Labspinner Inc.	EX-R1001	התקן הפעלה עבור Exodisc
FBS מדולדל אקסוזום	תרמו פישר סיינטיפיק	A2720801	חומר מזין של מדיה תרבית תאים עבור קו תאים PC3 נגזר EV אוסף
סרום בקר עוברי (FBS)	VWR	1500-500	חומר מזין לגידול תאים
עיזים נגד עכבר IgG H&L preadsorbed	ABCAM	dorit_19999	נוגדן IgG עכבר לשליטה negatvie של תיוג EV
Ibidi ארה"ב צלחת U μ-צלחת 35 מ"מ	איבידי	81156	צלחת תרבית להדמיה קונפוקלית
אימריס 9.7.1	אוקספורד אינסטרומנטס	9.7.1	תוכנה לעיבוד לאחר תמונה
מערכת אינקובטור + מערבל גז CO2/O2/N2	מכשיר תא חי	טו-או-20	מערכת אינקובטור להדמיית תאים חיים
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 מצלמה	ניקון	נה	מצלמה להדמיה קונפוקלית
מיקרוסקופ Nikon Eclipse Ti	ניקון	נה	מיקרוסקופ הפוך לדימות קונפוקלי
שקל-אלמנטס AR 4.50.00	ניקון	4.50.00	תוכנה לעיבוד תמונה עבור מיקרוסקופ Nikon
NTA, NanoSight NS500	מלוורן פנאליטי	NS500	מכשיר מדידה לריכוז EV
אוריג'יןפרו 2020	OriginLab	9.7.0.185	תוכנת גרפים
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	אנטיביוטיקה לגידול תאים
RPMI 1640	תרמו פישר סיינטיפיק	21875034	מדיה לתרבית תאים לטיפוח קו תאים PC3
SYTO RNASאלקט כתם תא פלואורסצנטי ירוק - תמיסה של 5 mM ב- DMSO	תרמו פישר סיינטיפיק	S32703	צבע פלואורסצנטי מכתים RNA לסימון EV