בדיקת לכידת החלקיקים דמויי הנגיף: שיטה לבידוד VLPs המציגים אנטיגן מדגימה באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים לנוגדנים מנטרלים

תקציר

מקור: Rosengarten, J. F., et al. איתור אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה. J. Vis. Exp. (2022).

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת משקעים חיסוניים, הנקראת בדיקת לכידת VLP, כדי לבודד חלקיקים דמויי וירוסים המציגים אנטיגן, או VLPs, מדגימה. האנטיגן נקשר עם נוגדנים ספציפיים הקשורים לחרוזים מגנטיים, ויוצר קומפלקס נוגדנים אנטיגן משותק המופרד מאוחר יותר ומאוחסן לניתוח נוסף.

פרוטוקול

1. הכנת דוגמאות

1. זרעו את קווי תאי ההשעיה של יצרן ה-VLP הנגזרים מתאי 293-F המבטאים גנים מבניים של HIV לבד או בתיאום עם env בצפיפות תאים נמוכה של 0.5 x 10⁶ תאים למ"ל בתווך ביטוי 293-F.
2. תן להם להתרחב במשך 3-4 ימים ב 37 ° C ו 8% CO₂ בסיבוב אינקובטור שייקר עם מסלול של 5 ס"מ ו 135 סיבובים לדקה (סל"ד).
3. גלול את תאי היצרן על ידי צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 5 דקות. לסנן את supernatant מזוקק כדי להסיר תאים שיורית פסולת התא באמצעות 0.45 מיקרומטר פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) מסנני מזרק קרום כדי לקבל supernatant תרבית תאים ללא תאים (CFSN).
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. CFSN ניתן לאחסן לילה ב 4 ° C.
4. או להשתמש CFSN ישירות עבור הניסוי או VLPs גלולה מ 35 מ"ל של CFSN באמצעות אולטרה צנטריפוגה (112,700 x גרם, 4 ° C, 1.5 שעות).
5. בעת אולטרה-צנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות את כדורי ה-VLP ב-200 מיקרוליטר של 15% (w/v) תמיסת טרהלוז ב-% צינור צנטריפוגה.
   הערה: גלולת VLP לעתים קרובות אינה נראית לעין בלתי. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן VLPs בטמפרטורה של -80°C.
6. לפני בדיקת לכידת VLP, קבע את ריכוזי חלבון הליבה הנגיפי בדגימות המכילות VLP באמצעות ELISA. שלב זה חשוב כדי לתקנן את קלט בדיקת הלכידה.

2. בדיקת לכידת VLP

NOTE: מבט כולל על זרימת העבודה מתואר באיור 1.

1. השהה את החרוזים המגנטיים על ידי פיטום למעלה ולמטה או ערבוב על מסובב במהירות 50 סל"ד למשך 5 דקות לפחות.
2. בינתיים, הכינו את תמיסת הנוגדנים המכילה את ה-bNAbs. יש להשתמש ב-10 מיקרוגרם של כל bNAb ב-200 מיקרוליטר של קשירת נוגדנים וחיץ שטיפה (ראה טבלת חומרים) לכל תגובה.
   הערה: כמויות הנוגדנים עשויות להשתנות בהתאם לזיקה של bNAb וצפיפות קישוט האנטיגן ב-VLPs שבהם נעשה שימוש.
3. השתמש ב- 50 μL של תמיסת החרוזים המגנטיים (ראה טבלת חומרים) לכל תגובה והעבר את החרוזים לצינור תגובה של 1.5 מ"ל. הניחו את הצינורות על מדף ההפרדה המגנטית.
   הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במגנט יחיד חזק עבור כל צינור כדי להפריד את החרוזים מהסופרנטנט.
4. המתינו מספר דקות עד שהחרוזים יתאספו בדופן הצינור כדי לוודא שכל החרוזים נאספים. הסר את supernatant.
5. הסר את המגנט והשהה את החרוזים ב 200 μL של תמיסת bNAb שהוכנה בשלב 2.2. דגירה במשך 30 דקות עד 3 שעות ערבוב על מסובב ב 50 סל"ד בטמפרטורת החדר.
6. הניחו שוב את צינורות התגובה במדף ההפרדה המגנטית, המתינו והוציאו את הסופרנטנט.
7. הסר את הצינורות מהמגנט ושטוף את החרוזים על ידי השעיה מחדש של 200 μL של קשירת נוגדנים וחיץ כביסה.
8. חזור על שלב 2.4. הסירו כמה שיותר את מאגר הכביסה.
9. הוסף את הדגימות ל- bNAbs.
   הקשור לחרוזים הערה: קלט ה- VLP עבור בדיקת הלכידה באמצעות חלקיקים שמקורם ב- HIV צריך להיות לפחות 15 ננוגרם של חלבון ליבה נגיפי לכל תגובה. כמויות VLP עשויות להשתנות בהתאם לזיקה של bNAb, וצפיפות קישוט האנטיגן על VLPs בשימוש.
10. אם נפח הדגימה שנוסף בשלב 2.9 נמוך מ- 1 מ"ל, הוסף PBS כדי להתאים את נפח הדגימה ל- 1 מ"ל. להשהות את החרוזים בעדינות על ידי pipetting.
11. דגרו על הדגימות והחרוזים במשך 2.5 שעות על מסובב בטמפרטורת החדר. מוודאים שהחרוזים נשארים בתרחיף והתמיסה מעורבבת היטב במהלך הדגירה.
12. מניחים את הצינורות על המגנט ומסירים את הסופרנטנט.
13. שטפו את החרוזים המגנטיים על ידי השעייתם ב-200 מיקרוליטר של חיץ כביסה (ראו טבלת חומרים). חזרו על שלב הכביסה שלוש פעמים.
14. השהו את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה והעבירו את המתלה לצינור תגובה נקי (עמיד בחום).
15. הניחו את הצינור על מדף ההפרדה המגנטי (ראו טבלת חומרים) והוציאו את הסופרנאטנט לחלוטין.
16. הכן דגימות SDS-PAGE שעברו דנטורציה לפי שלבים 2.16.1-2.16.2 או דגימות שאינן מפורקות על-ידי הדבקת ה-VLPs מהחרוזים המגנטיים לפי שלבים 2.16.3-2.16.5.
    1. כדי להכין דגימות SDS-PAGE מפורק יש להשהות את החרוזים ב-20-80 μL של מאגר Laemmli (0.8 μL של מאגר Laemmli לכל 1 ng של קלט בדיקת p55 Gag) ולדגור ב-95°C למשך 5 דקות.
    2. המשך ישירות עם SDS-PAGE או אחסן את הדגימות ב- -20 °C.
       זהירות: מאגר Laemmli מכיל 2-מרקפטואתנול ונתרן דודציל סולפט. יש ללבוש כפפות מגן והגנה על העיניים. יש להימנע ממגע עם העור, העיניים והבגדים. אין לשאוף אדים. עבודה בחלל מאוורר היטב, למשל, מכסה אדים.
       הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
    3. לחלופין, בצע שלב אלוציה ללא דנטורציה כדי לקבל VLPs עם מבנה חלבון טבעי שמור.
    4. מוסיפים 25 μL של חיץ אלוציה (מסופק לעתים קרובות עם החרוזים) לחרוזים המגנטיים ודגרים במשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. מוציאים את החרוזים ומעבירים את הפליט לצינור נקי. השתמש ב- eluate עבור הבדיקות הבאות או אחסן אותו ב- 4 °C.
       הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

תוצאות

איור 1: המחשה סכמטית של שלבי מפתח של בדיקת לכידת VLP באמצעות סופרנאטנטים נטולי תאים. (1) בדיקת לכידת VLP מתחילה בקשירת bNAbs של HIV-1 לחרוזים מגנטיים מצומדים G חלבוניים. בינתיים, פתרון VLP עם ריכוז מוגדר p55 מוכן. הסופרנאטנט של תרבית ללא תאים מורכב מתערובת של p55 Gag VLPs, חלבוני התא המארח וחומצות גרעין. (2) החרוזים המגנטיים המחוברים ל-bNAbs ולתמיסת ה-VLP מועברים לצי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 מ"ל צינורות תגובה	אפנדורף
10x PBS	גיבקו	70011044
נוגדנים (bnAbs)	פולימון סיינטיק
Dynabeads חלבון G ערכת משקעים חיסוניים	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007ד	כולל חוצצים וכביסה פתרונות
תאי סגנון חופשי 293-F	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	₪190-07
סגנון חופשי 293 ביטוי בינוני	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
מתלה הפרדה מגנטית	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	S1509S	עבור צינורות 12 x 1.5 מ"ל או 6 x 1.5 מ"ל
Optima XE-90 אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר
פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) מסנני מזרק, 0.45 מיקרומטר	קרל רות'	KC89.1
PVDF transfermembrane, 0.45 מיקרומטר	קרל רות'	T830.1
QuickTiter HIV p24 ELISA	מעבדות ביולוגיות של תאים	VPK-108-H
מסובב	היידולף	REAX2
רוטור SW28	בקמן קולטר
תרמומיקסר	Cel מדיה	בסיסי
טרהלוז דיהידראט	קרל רות'	8897.2
צינורות צנטריפוגות שקופים במיוחד	בקמן קולטר	344058