$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. עיצוב תא חדש (איור 1)
- פתח לוח מנתח תאים דו-תאי חדש. הניחו בצד את התא העליון עם אלקטרודות.
- באמצעות מכונת כרסום, לגלח 2 מ"מ של בארות תחתונות בצורת U של צלחת אנלייזר התא.
- חבר קרום פוליאתרסולפון (PES) בגודל 2 ס"מ x 7 ס"מ עם גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר לתחתית הבארות המגולחות באמצעות דבק אוצר UV. יש להמתין זמן אצירה של 30 דקות כדי להבטיח שהדבק נרפא לחלוטין ואינו פעיל.
- באמצעות מכונת כרסום, חתכו שני חריצים אורכיים (1.5 מ"מ x 5.6 מ"מ) לאורך הצדדים כדי להיצמד לרכסים של החדר השלישי שזה עתה יוצר.
- באמצעות מכונת כרסום, צור תא פוליקרבונט שלישי המשכפל את הממדים הכוללים של לוח מנתח התא; 72 מ"מ x 18 מ"מ (רשימת חומרים).
- צור בארות בעומק 4.8 מ"מ וקוטר 4.75 מ"מ כדי לשכפל את העיצוב בן 16 הקידוחים של לוח מנתח התא. זה מאפשר 90 μL של נפח לכל באר.
- בצדדים, צרו שני רכסים משולשים כך שהתא ננעל לתוך החרכים המקוריים שנוצרו בשלב 1.4. החלק האופקי של המשולש הוא 1.5 מ"מ, האנכי הוא 1.4 מ"מ, ואת hypotenuse הוא 2.052 מ"מ.
- צרו ידית בצד הקצר בקוטר 50.8 מ"מ ובגובה 1.397 מ"מ כדי להתאים לחריץ של הלוח המקורי (איור 1, באמצע).
- השתמש במכונת כביסה גומי בעובי 0.9 מ"מ עבור כל באר כדי לספק התאמה אטומה.
2. תרבית תאים (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasts)
- שטפו תרביות תאים דבקים (~70% מפגש) עם 1x מלח חוצץ פוספט (PBS).
- הוסף תמיסת טריפסין-EDTA 0.05% כדי להרים את התאים.
- נטרלו את תמיסת הטריפסין עם מדיית תרבית תאים המכילה סרום וספרו את התאים באמצעות aliquot של תרחיף התא.
הערה: ניתן למצוא את המדיה הספציפית של תרביות תאים בטבלה 1.
3. דיסוציאציה של xenograft שמקורה במטופל
- קוצצים חתיכת גידול טרי (1 ס"מ2) לדייסה דקה בעזרת אזמל סטרילי.
- מניחים בצינור חרוטי של 50 מ"ל עם 20 מ"ל של מדיה DMEM F12 בתוספת טריפסין 3 מ"ג / מ"ל ו 2 מ"ג / מ"ל collagenase.
- יש לדגור בשייקר תרמי (150 סל"ד) ב-37°C למשך 20 דקות.
- סובב את הצינור ב 500 x גרם במשך 5 דקות; להסיר את supernatant.
- הוסף 20 μL של DMEM F12 + 2% FBS כדי לשטוף את התאים; סחרור ב 300 x גרם במשך 5 דקות והסר את supernatant. חזרו על הכביסה פעמיים נוספות.
- השהה מחדש ב- 1 מ"ל של מדיית PDX (טבלה 1) כדי לספור את התאים.
4. מיצוי תאי מח עצם
- יש לשטוף את מסנן איסוף מח העצם (BM) עם 25 מ"ל של 1x PBS.
הערה: במחקר זה, PBS נוסף למסנן איסוף BM משומש מבית החולים כדי לאסוף את BM שנותר במסנן.
- מוסיפים את BM סמוק לאט לצינור חרוטי 50 מ"ל עם 25 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות, דואגים לשמור על השכבות נפרדות ככל האפשר.
- סחור ב 800 x גרם במשך 20 דקות ב 18 ° C.
- מסננים את השכבות העליונות לאחר צנטריפוגה (שומן/פלזמה) ומעבירים 5 מ"ל מהשכבה הלבנה מעל מדיום שיפוע הצפיפות שיש לו את תאי BM לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
הערה: לחילופין, טובלים פיפטה 5 מ"ל בשכבה העליונה עד שהיא נוגעת בשכבה האמצעית (BM), ופיפטה החוצה את השכבה האמצעית לאט מאוד מבלי להזיז את הפיפטה.
- מלא את הצינור החרוטי 15 מ"ל עם 1x PBS (~ 10 מ"ל) וסחרור ב 300 x גרם במשך 15 דקות.
- הסר את הסופרנטנט; הגלולה הלבנה הנותרת היא BM.
- אם תאי דם אדומים נצפים בכדור, להוסיף 5 מ"ל של תמיסת RBC lysis (טבלה של חומרים) ולתת לו לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). סובבים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- מוסיפים 10 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את התאים, מסתובבים ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. חזור על ליזה RBC (שלב 4.7) עד שהגלולה לבנה.
5. זריעה והרכבה של תאים
- הניחו את כל שלושת התאים הסטריליים במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
- מקמו את הידית בצד הקצר של החדר התחתון. כיוון החדר התחתון כך שהידית פונה אל הנסיין.
- הוסף 30,000-50,000 תאים ב 90 μL של מדיה לכל באר של החדר התחתון. הימנעו מיצירת בועות. אלה הם תאי סטרומה שיספקו גורמים מופרשים אך לא יזוהו על ידי האלקטרודות של החדר העליון.
- יש להשתמש ב-5% תוספת לסרום בקר עוברי בשתי בארות בתאים התחתונים כבקרה חיובית לתנועתיות התאים. יש להשתמש במדיה עם תוספת סרום 0% כבקרה שלילית.
- תן לתא התחתון עם התאים לשבת במשך 10-15 דקות במכסה המנוע כדי להתיישב.
הערה: שלב זה מומלץ אם התאים דבקים או גדלים בתרחיף.
- סובב את התא התחתון ב- 90° והנח את החדר האמצעי למעלה כך שהידית בתא התחתון תחליק לחריץ בתא האמצעי.
הערה: הידית בתא התחתון והנקודה הכחולה בתא האמצעי נמצאות בקצוות מנוגדים של ההרכבה.
- דחפו אנכית למטה עד שיישמע צליל קליק מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.
- הוסף 160 μL של מדיה ללא סרום לכל הבארות של החדר האמצעי.
- ודא מניסקוס בצורת כיפה גלוי לאחר מילוי הבארות; אחרת, להתאים את הנפח הסופי על סמך כיול פיפטה. הימנעו מיצירת בועות.
- הניחו את התא העליון עם אלקטרודות הפונות כלפי מטה אל התא האמצעי, והקפידו ליישר את הנקודות הכחולות על החדר האמצעי והעליון.
- דחפו אנכית למטה עד שיישמע צליל קליק מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.
- הוסף 25-50 μL של מדיה ללא סרום לתא העליון.
- הרכיבו את המכלול על מנתח התאים הדו-שימושי באינקובטור תרביות הרקמה והמתינו 30 דקות לפני מדידת הרקע.
הערה: זמן זה נחוץ כדי לאזן את המערך וניתן להשתמש בו כדי להכין את קווי התא שיתווספו לתא העליון.
- מדדו את הרקע (ראו סעיף 6) והחזירו את המכלול למכסה המנוע של תרבית הרקמה.
- הוסף 30,000-50,000 תאים ב 100 μL של מדיה ללא סרום לכל באר של החדר העליון. אלה הם התאים שהאלקטרודה תזהה ברגע שהם ינדדו בהצלחה דרך הממברנה
הערה: כדי להשיג תגובה מקסימלית, מומלץ לגדל תאים במדיה ללא סרום או בסרום נמוך במשך 6-18 שעות לפני ביצוע הבדיקה.
- הניחו למכלול לעמוד במכסה המנוע למשך 30 דקות לפני הרכבה על מנתח התאים הדו-שימושי למדידת עכבה.
6. מדידת רקע ועכבה
- מקם את המערך בעריסה של מכשיר מנתח התאים הדו-תכליתי.
- פתח את תוכנת מנתח התאים ובחר את העריסה שבה יש להשתמש.
- לחץ על הכרטיסייה הודעה וודא שכתוב חיבורים בסדר כדי לוודא שהמערך ממוקם היטב בעריסה והאלקטרודות מיושרות היטב עם החיישנים.
- לחץ על הכרטיסייה הערות ניסוי ומלא מידע רב ככל האפשר על הניסוי.
- לחץ על הכרטיסייה פריסה ומלא את תיאור פריסת המערך.
- לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים והוסף שני שלבים מתפריט השלבים; שלב רקע (טאטוא אחד) ושלב בדיקה עם 100 טאטוא - טאטוא כל 15 דקות, בסך הכל 25 שעות.
- לאחר שהמערך היה באינקובטור מנתח התאים הדו-תכליתי במשך 30 דקות, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל במדידת רקע. חלון המבקש לבחור את התיקיה לשמירת הנתונים יופיע.
- לאחר ביצוע מדידת הרקע, הסר את המערך מהעריסה והחזיר אותו למכסה המנוע של תרבית התא.
- הוסף תאים לתא העליון כמתואר בשלב 5.13, ושמור את המכלול במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך 30 דקות כדי שהתאים יתיישבו.
- החזיר את המערך למנתח התאים הדו-תכליתי ובדוק בכרטיסיה הודעה את ההודעה אישור חיבורים.
- לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל במדידת עכבה.
- לחץ על הכרטיסייה מגרש כדי לעקוב אחר התקדמות האות.
- אם מגיעים לנקודת הקצה לפני 25 שעות, לחץ על שלב ביטול מהתפריט הנפתח ביצוע.
- כדי לייצא נתונים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגרף, בחר העתק בתבנית הרשימה ולאחר מכן הדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני.
הערה: ניתן לייצא את הנתונים כאינדקס תאים או כאינדקס תאי דלתא. ניתן גם לבחור נתוני תרשים ו/או פריסה לייצוא.
טבלה 1: הרכב מדיה של תרבית תאים. הטבלה מפרטת את ההרכבים של מדיית MDA-MD-231, מדיית פיברובלסטים J2, מדיית DCIS ומדיית PDX.
| מדיה | מרכיבי המדד | ריכוז/פרופורציה |
| מד"א-MD-231 מדיה | DMEM | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | 10% |
| J2 פיברובלסטים מדיה | DMEM | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | 10% |
| מדיית DCIS | DMEM F12 | |
| סרום סוסים (HS) | 5% |
| גורם גדילה אפידרמיס (EGF) | 20 נ"ג/מ"ל |
| אינסולין | 10 מיקרוגרם/מ"ל |
| הידרוקורטיזון | 0.5 מיקרוגרם/מ"ל |
| רעלן כולרה | 100 ננוגרם/מ"ל |
| מדיית PDX | DMEM F12 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | 2% |
| HEPES | 1 מטר |
| אינסולין טרנספרין סלניום אתנולאמין (ITS) | 10 מיקרוגרם/מ"ל |
| הידרוקורטיזון | 0.5 מיקרוגרם/מ"ל |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) | 1 מ"ג/מ"ל |
