בדיקת פעילות ציטראט סינתאז: בדיקה קולורימטרית למדידת פעילות סינתאז ציטראט מיטוכונדריאלי בהומוגנט רקמות דרוזופילה

תקציר

מקור: Wei, P., et al., A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת בדיקת פעילות סינתאז ציטראט מיטוכונדריאלי הקיימת בהומוגנט הרקמה של דרוזופילה.

פרוטוקול

1. בדיקת פעילות קולורימטרי ציטראט סינתאז עבור D. melanogaster

1. אספו עשרה זבובים בוגרים עבור כל דגימה. לאסוף לפחות דגימות משולשות עבור כל גנוטיפ.
2. הכינו 500 μL של חיץ מיצוי קר כקרח המכיל 20 mM HEPES (pH = 7.2), 1 mM EDTA ו-0.1% טריטון X-100 במבחנה של 1.5 מ"ל עבור כל דגימה.
3. מרדימים זבובים בוגרים עם_CO2 על כרית הרדמה ומבודדים את הרקמות הרצויות. כדי לבודד את בית החזה של הזבוב הבוגר, למשל, קבע את בית החזה של הזבוב על ידי זוג מלקחיים, ולאחר מכן בודד את בטן הזבוב על ידי חיתוך לאורך גבול בית החזה והבטן באמצעות זוג מספריים. לאסוף את בית החזה זבוב עבור שריר ציטראט סינתאז פעילות assay.
   הערה: קבע את המשקל הטרי של הרקמה בשלב זה אם אתה משתמש בו כדי לנרמל את פעילות ציטראט סינתאז.
4. העבירו 10 בתי חזה של זבובים בוגרים ל-100 מיקרוליטר של חיץ מיצוי קר כקרח באופן מיידי והומוגניזציה עם מזיק על קרח. כדי לשמור על הדגימות קרות כקרח, הומוגניזציה של הדגימות במשך 5-10 שניות על קרח, ואז יש את הדגימות לשבת על קרח במשך 5 שניות, ולחזור על הפעולה עד שכל הרקמות בצינור הומוגניות לחלוטין.
   הערה: קלט את הצינור, לבדוק את homogenates כדי לוודא כי אין קרישי הומוגנט וכי הרקמות בצינור הומוגניים לחלוטין. כל הטיפולים לדוגמה צריכים להתבצע על קרח.
5. קח 10 μL מכל דגימה הומוגנית בצינור חדש למדידת תכולת חלבון. שמור את הדגימות למדידת חלבון על ice.
   הערה: ניתן להקפיא את דגימות החלבון ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80°C לצורך ניתוח מאוחר יותר. ריכוזי החלבונים משמשים כפרמטר פנימי לנורמליזציה של פעילות ציטראט סינתאז.
6. הוסף 400 μL של חיץ מיצוי קר כקרח לכל דגימה שנותרה כדי ליצור נפח כולל של 500 μL. ערבב היטב על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה לפחות 5x, הימנעות היווצרות בועות. עבור כל תגובה, הוסף 1 μL של ליזט תא מדולל ל 150 μL של תמיסת התגובה המוכנה החדשה (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 mM אצטיל CoA, 1 mM חומצה אוקסלואצטית). מערבבים היטב ומיד על ידי פיפטוף עדין, הימנעות היווצרות בועות. מדוד את הספיגה ב-412 ננומטר כל 10-30 שניות למשך 4 דקות ב-25°C באמצעות קורא לוחות המסוגל למדוד ספיגה ב-412 ננומטר במרווחי זמן מינימליים של 10 s.
   הערה: החליפו את החוד לפני יצירת מגיב אחר והימנעו מיצירת בועות בבארות. ערבוב לא שלם של הריאגנטים עלול לגרום לשינויים במדידות. בדיקת פעילות סינתאז ציטראט צריכה להיעשות בטמפרטורת החדר מיד לאחר איסוף הדגימות, שכן בדיקה זו משמשת לכימות מסה מיטוכונדריאלית שלמה. יש להכין את מאגר התגובה מיד לפני השימוש ואין לאחסן אותו.
7. התווה נתונים כספיגת צפיפות אופטית (OD) (ABS) (ציר Y) לעומת זמן (בדקות) (ציר X). לאחר מכן חשב את השיפוע עבור החלק הליניארי של העקומה, כאשר קצב התגובה הוא
   
   חלק את הערך בריכוז חלבון הדגימה כדי לנרמל את פעילות סינתאז ציטראט. פעילות סינתאז ציטראט מחושבת כ
   
   הערה: ניתן למדוד את ריכוז החלבון לדוגמה על ידי ערכת בדיקת ריכוז חלבון.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)-1- פיפרזיניל]חומצה אתנסולפונית (HEPES)	סיגמא-אולדריץ'	V900477
2-אמינו-2-(הידרוקסימתיל)-1,3- פרופנדיול (בסיס TRIZMA)	סיגמא-אולדריץ'	V900483
אצטיל-CoA	סיגמא-אולדריץ'	A2181
חומצה דיתיו-ביס-ניטרובנזואית (DTNB)	סיגמא-אולדריץ'	D8130
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)	סיגמא-אולדריץ'	V900106
אוקסלואצטט	סיגמא-אולדריץ'	O4126
גלולה פסטל	סנגון	F619072
מנוע גלולה פסטל	טינגן	OSE-Y10
קורא צלחות	ביוטק	איאון
ערכת בדיקת חלבון BCA	ביוטיים	P0010S
מספריים	WPI	14124
טריטון X-100	סנגון	A110694-0100