בדיקת הגנת אנזים מבוססת ליזוסטפין: שיטה חוץ גופית לכימות עומס סטפילוקוקוס זהוב תוך תאי על ידי הרג סלקטיבי בתיווך אנזים של חיידקים חוץ-תאיים

תקציר

מקור: Rigaill, J. et al. בדיקת הגנת אנזימים משופרת לחקר הפנמה של סטפילוקוקוס זהוב ויעילות תוך-תאית של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת הגנה מפני אנזים במבחנה המבוססת על ליזוסטפין כדי לכמת את הפנמת Staphylococcus aureus בתאי A549. הבדיקה מסייעת במחקרים איכותניים, כמותיים ואפיונים של עומס החיידקים התוך-תאיים בתאים המארחים.

פרוטוקול

1. חיסון תאים

1. התחל עם תרבית של תאי אפיתל אנושיים A549 בגלוקוז גבוה מסוג Eagle medium (DMEM) של Dulbecco עם פנול אדום, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ללא אנטיביוטיקה.
2. התבונן בכל באר של צלחת 24 בארות על ידי מיקרוסקופ הגדלה נמוכה כדי להבטיח כי תאי אפיתל אנושיים בריאים וגדלים כצפוי.
3. מוציאים ומשליכים את מדיום תרבית התאים המשומש מהצלחת בעלת 24 הקידוחים.
4. הוסף 500 μL של תרחיף חיידקי של Staphylococcus aureus מוכן DMEM ללא פנול אדום, עבור חיסון לכל באר עם 100% תאים confluent.
5. לדגור על התאים במשך 2 שעות ב 36 ± 1 ° C ו 5% CO₂.
   הערה: מומלץ להשתמש בשלוש בארות של הצלחת עבור כל מצב שייבדק (משולש) ולבצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. ניתן להתאים את עיכוב הדגירה בהתאם למטרת הניסוי.

2. כימות חיידקים תוך-תאיים עם בדיקת הגנת אנזימים משופרת (iEPA)

1. הכינו 7 מ"ל של חיץ ליזיס 4x עם 3.5 מ"ל של 2% Triton X-100 במים סטריליים ו-3.5 מ"ל של טריפסין-EDTA.
2. הכינו תמיסת מלאי ליזוסטפין במינון 10 מ"ג/מ"ל במאגר אצטט והזרימו 25 מיקרוליטר לקריביאלים. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C למשך עד 6 חודשים.
3. הכן 250 μL של תמיסת עבודה ליזוסטפין טרייה במינון 1 מ"ג/מ"ל על ידי ערבוב 25 μL של תמיסת מלאי הליזוסטפין (10 מ"ג/מ"ל) ו-225 μL של 0.1 M Tris-HCl. יש לאחסן ב-4°C למשך עד 48 שעות.
4. הכן 6.25 מ"ל של מדיום זיהום מלא בתוספת lysostaphin על ידי הוספת 6 מ"ל של זיהום מלא בינוני ל 250 μL של פתרון העבודה lysostaphin.
5. הוסף 250 μL של מדיום זיהום מלא בתוספת lysostaphin לתוך כל באר בעדינות להסעיר את הצלחת על ידי סיבוב הצלחת ביד.
6. לדגור על התאים במשך 1 שעות ב 36 ± 1 ° C ב 5% CO₂ כדי לתת lysostaphin להרוג את החיידקים התאיים.
7. בסוף זמן הדגירה, להוסיף 10 μL של proteinase K ב 20 מ"ג / מ"ל לתוך כל באר כדי להשבית את lysostaphin.
8. דוגרים על התאים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
9. הוסף 250 μL של חיץ ליזיס 4x כדי ליזה את התאים על ידי הלם אוסמוטי.
10. לדגור על התאים במשך 10 דקות ב 36 ± 1 מעלות צלזיוס.
11. מערבבים היטב על ידי פיטינג למעלה ולמטה עשר פעמים בכל תחתית הבאר כדי להבטיח שהתאים עוברים ליזה מלאה והומוגנית.
12. השתמש בפלטר ספירלי אוטומטי כדי לקבוע את עומס S. aureus של כל באר.
13. לדגור על צלחות אגר במשך 18-24 שעות ב 36 ± 1 מעלות צלזיוס.
14. למחרת, ספרו את מספר המושבות עם מונה מושבה כדי לחשב את העומס התוך-תאי S. aureus של כל באר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 24 בארות	קורנינג-פלקון	353047
קו תאים A549	ATCC	CCL-185
תמיסת חיץ אצטט pH 4.6	פלוקה	31048	משמש להכנת תמיסת מלאי lysostpahine ב 10 מ"ג / מ"ל ב 20 mM נתרן אצטט.
אמביצין (ליזוסטפין רקומביננטי)	אמבי	LSPN-50	Lyophilized recominant lysostaphin. יש להקפיא בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.
COS - אגר קולומביאני + 5% דם כבשים	ביומריו	43049	ניתן להשתמש בכל צלחת אגר המתאימה לגידול סטפילוקוקים במקום.
Dulbecco's Differentified Eagle's Medium, גלוקוז גבוה עם פנול אדום	סיגמא-אולדריץ'	D6429
Dulbecco's Differentified Eagle's Medium, גלוקוז גבוה ללא פנול אדום	סיגמא-אולדריץ'	D1145
פוספט של דולבקו חוצץ מלוחים	סיגמא-אולדריץ'	D8537
Dulbecco′ מלח חוצץ פוספט עם MgCl2 ו-CaCl2, מסונן סטרילי	סיגמא-אולדריץ'	D8662
Dulbecco′ מלח חוצץ פוספט, מסונן סטרילי	סיגמא-אולדריץ'	D8537
דילול Easyspiral	אינטרסיינס	414000	מדלל אוטומטי ופלטה ספירלית
סרום בקר עוברי	גיבקו	10270-106
פרוטאינאז K, רקומביננטי 20 מ"ג/מ"ל	יורוביו	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, הרבה 901727
סריקה 4000	אינטרסיינס	438000	מונה מושבה אוטומטי
מים סטריליים	OTEC	600500
מונה תאים אוטומטי TC20	ביוראד	1450102	מונה תאים אוטומטי
טריס 1 מטר pH 8.0	Invitrogen	AM9855G	משמש להכנת תמיסת עבודה lysostaphine ב 1 מ"ג / מ"ל ב 0.1 M Tris-HCl.
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	T8787
טריפסין - תמיסת EDTA	סיגמא-אולדריץ'	T3924	0.05% טריפסין חזירי ו-0.02% EDTA בהנקס′ תמיסת מלח מאוזנת עם פנול אדום
מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה	ניקון	טי2