$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE
1. הכנת הפתרון
הערה: טפל והכן את כל הריאגנטים והתמיסות עם כלי זכוכית ללא ברזל או כלי פלסטיק חד פעמיים. אין לאפשר לחומרי מעבדה מתכתיים (למשל, מריות נירוסטה) לבוא במגע עם מגיב או תמיסה כלשהם, בשל הסיכון לזיהום ברזל. ודאו שכל כלי זכוכית רב פעמיים אינם מכילים ברזל. יש לשטוף את החומרים עם חומר ניקוי מתאים למעבדה למשך 30-60 דקות, לשטוף במים שעברו דה-יוניזציה, להשרות למשך הלילה בתמיסת חומצה חנקתית 37% מהולה ביחס 1:3 במים נטולי יונים, לשטוף שוב במים שעברו דה-יוניזציה ולאפשר להם להתייבש.
- תערובת חומצה: מוסיפים 10 גרם חומצה טריכלורואצטית ל-82.2 מ"ל של 37% חומצה הידרוכלורית בבקבוק זכוכית, ממיסים היטב ומתאימים את הנפח הסופי ל-100 מ"ל עם מים נטולי יונים. יש לנער לפני השימוש. לחלופין, יש להשתמש רק בחומצה הידרוכלורית 37% לעיכול רקמות.
הערה: הפתרון יציב לפחות 2 חודשים כאשר מאוחסן בקבוקי מגיב זכוכית חום כהה.
זהירות: חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית הן קורוזיביות, וצורות מרוכזות משחררות אדים חומציים רעילים. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בכל עת בעת טיפול בחומצות. הימנעו מלנשום אותם פנימה ותמיד טפלו בחומצות כשאתם מתחת למכסה האדים.
- נתרן אצטט רווי: יש להוסיף 228 גרם נתרן אצטט נטול מים ל-400 מ"ל מים נטולי יונים, ולהתסיס במשך הלילה בטמפרטורת החדר. תן לפתרון לנוח ולזרז במשך יום. אם לא מתרחשים משקעים, המשיכו להוסיף כמויות קטנות של נתרן אצטט. אחסנו את התמיסה בבקבוק זכוכית.
- מגיב כרומוגן: כדי להכין 1 מ"ל של מגיב כרומוגן, להוסיף 1 מ"ג של 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline disulfonic חומצה מלח דיסודיום ל 500 μL של מים deionized ו 10 μL של מרוכז (100%) חומצה thioglycolic, ולהמיס היטב. לפצות את נפח הסופי עד 1 מ"ל עם מים deionized.
הערה: הכינו ריאגנט כרומוגן רב ככל שיידרש. הפתרון יציב במשך חודש אחד כאשר מוגן מפני אור.
- מגיב כרומוגן עובד (WCR): הוסף נפח אחד של מגיב כרומוגן ל- 5 כרכים של נתרן אצטט רווי ו- 5 כרכים של מים שעברו דה-יוניזציה.
הערה: פתרון זה צריך להיות מוכן טרי ביום השימוש.
- תמיסת ברזל סטנדרטית: להכנת תמיסת ברזל בנפח 20 מ"מ, יש להניח 111.5 מ"ג אבקת ברזל קרבוניל בבקבוק נפחי בנפח 250 מ"ל המכיל 5,480 מיקרוליטר של 37% חומצה הידרוכלורית. השאירו להתמוסס למשך הלילה בטמפרטורת החדר (או לדגור באמבט מים רותחים). לאחר מכן, לפצות את הפתרון לנפח סופי של 100 מ"ל עם מים deionized.
הערה: הפתרון הסטנדרטי יכול להישמר ללא הגבלת זמן כאשר מאוחסן בכלי אטום היטב.
- תמיסת ברזל סטנדרטית (WISS): הוסף 13.5 μL של 37% חומצה הידרוכלורית ל-500 μL של מים שעברו דה-יוניזציה. הוסף 10 μL של תמיסת Stock Iron Standard Solution והשלם את הנפח הסופי ל-1 מ"ל עם מים נטולי יונים, (11.169 מיקרוגרם Fe/mL, 200 μM; נמדד על ידי AAS).
הערה: פתרון העבודה צריך להיות מוכן טרי ביום השימוש.
2. ייבוש לדוגמה
- חותכים מדגם של רקמה במשקל 10-100 מ"ג עם להב אזמל. שקלו אותו במדויק באיזון אנליטי/מדויק על פיסת פרפילם קטנה (משקל טרי).
- בעזרת פינצטה מפלסטיק, הניחו את פיסת הרקמה בצלחת של 24 בארות (ללא מכסה כדי לאפשר אידוי מים) והניחו לה להתייבש באינקובטור סטנדרטי בטמפרטורה של 65°C למשך 48 שעות.
- לחלופין, השתמשו בתנור עיכול מיקרוגל במעבדה לייבוש דגימות רקמות. בעזרת פינצטה מפלסטיק, מניחים את פיסת הרקמה השקולה בכוס טפלון נטולת ברזל ומייבשים אותה במיקרוגל. הגדר את פרמטרי ההפעלה בהתאם למדריך הוראות המכשיר.
הערה: כהפניה, פרמטרי הפעלה לייבוש דגימות כבד באמצעות תנור העיכול הספציפי (ראו טבלת חומרים) מוצגים בטבלה 1.
- בעזרת פינצטה מפלסטיק, מניחים כל פיסת רקמה מיובשת על פיסת פרפילם קטנה בתוך איזון אנליטי/מדויק ושוקלים אותה במדויק (משקל יבש).
3. עיכול חומצי לדוגמה
- באמצעות פינצטה פלסטיק, להעביר כל פיסת רקמה מיובשת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- מוסיפים 1 מ"ל של תערובת חומצה ולסגור את צינור microcentrifuge. הכינו ריק חומצה באותו אופן, אלא שהרקמה מושמטת.
זהירות: תערובת החומצה היא קורוזיבית ומשחררת אדים רעילים. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בעת הטיפול בתערובת החומצה. הימנעו מלנשום אותו פנימה ותמיד טפלו בו מתחת למכסה האדים.
- לעכל את הרקמות על ידי דגירה צינורות microcentrifuge באינקובטור ב 65 ° C במשך 20 שעות.
- לאחר קירור לטמפרטורת החדר, מעבירים 500 μL של תמצית חומצה שקופה (צהובה) (supernatant) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל באמצעות מיקרופיפטה המצוידת בקצוות פלסטיק. אם לא ניתן להשיג סופרנטנט ברור, בצע סיבוב צנטריפוגה קצר.
זהירות: הסופרנאטנט חומצי מאוד. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בעת הטיפול בסופרנאטנטים. תמיד לטפל בהם תחת מכסה מנוע אדים.
הערה: בשלב זה, תמציות חומצה ניתן להשתמש מיד עבור הבדיקה colorimetric או קפוא ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. הפשירו לחלוטין דגימות קפואות לטמפרטורת החדר וערברו אותן לפני השימוש.
4. פיתוח צבע
- הכינו תגובות כרומוגן, כפי שמצוין בטבלה 2, בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל או, לתפוקה גבוהה יותר, ישירות לתוך תחתית שטוחה, 96 בארות, צלחות פוליסטירן שקופות ולא מטופלות. הכינו את כל התגובות (חומצה ריקה, סטנדרטית ומדגם) לפחות בכפילות.
- יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
5. קריאת ספיגה
- מדוד את בליעת הדגימה בספקטרופוטומטר או בקורא לוחות באורך גל של 535 ננומטר כנגד ייחוס מים שעברו דה-יוניזציה. ניתן לקרוא צלחות ללא מכסה או מכסה. במקרה המכסה, יש להסיר כל עיבוי שנוצר עקב שחרור אדי חומצה מהמכסה ממש לפני המדידה כדי למנוע הפרעה אפשרית לקריאת הספיגה.
הערה: הספיגה האופטית של הקריאה הריקה החומצית כנגד מים שעברו דה-יוניזציה (סימוכין) צריכה להיות קטנה מ-0.015; הספיגה האופטית של התקן והדגימות צריכה להיות בין 0.100 ל -1.000. עבור דגימות עם תכולת ברזל גבוהה מאוד או נמוכה מאוד, ייתכן שיהיה צורך להתאים את נפחי תמצית החומצה (supernatant) ו- diH2O (טבלה 2): אם הספיגה גדולה מ- 1.0, השתמש בנפח דגימה קטן יותר (supernatant); כאשר הספיגה נמוכה מ-0.1, יש להשתמש בנפח גבוה יותר של הסופרנטנט. נפח הדגימה (Vsmp) נלקח בחשבון בעת חישוב תכולת הברזל ברקמה של כל דגימה (ראה שלב 6).
6. חישוב תכולת ברזל רקמות
- חשב תכולת ברזל שאינה הם ברקמה באמצעות המשוואה הבאה:
ברזל רקמות (מק"ג/גר' רקמה יבשה) = משוואה 1
AT = קליטת דגימת בדיקה
AB = ספיגה של חומצה blank
AS = ספיגה של תקן
Fes = ריכוז ברזל של WISS (מיקרוגרם Fe/mL)
W = משקל הרקמה היבשה (g)
Vsmp = נפח דגימה (נפח משתנה של Supernatant בטבלה 2 מומר ל-mL)
Vf = נפח סופי של תערובת חומצה לאחר דגירה של לילה ב 65 ° C (המקביל לנפח חומצה בתוספת נפח רקמה יבשה במ"ל; אם משקלי הדגימה אינם שונים באופן משמעותי, נניח נפח קבוע ≈ 1 מ"ל)
Vstd = נפח סטנדרטי ברזל (נפח WISS בטבלה 2 מומר ל- mL)
Vrv = נפח התגובה הסופי (הנפח הכולל בטבלה 2 מומר למ"ל)
טבלה 1: פרמטרי הפעלה לייבוש כבד בתנור עיכול במיקרוגל המשמש כאן
| הספק 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| לחץ (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| זמן (דקות): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| זמן בלחץ (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| מאוורר: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
טבלה 2: הכנת תגובות כרומוגנים בצינורות של 1.5 מ"ל או בלוחות של 96 בארות.
| | WCR (μL) | תערובת חומצה (μL) | סופרנאטנט (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | נפח כולל (μL) |
| 1.5 צינורות מ"ל | חומצה ריקה | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| תקן | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| לדוגמה | 1000 | | משתנה | | משתנה | 1300 |
| 96-well microplate | חומצה ריקה | 150 | 22.5 | | | 22.5 | 195 |
| תקן | 150 | 22.5 | | 22.5 | | 195 |
| לדוגמה | 150 | | משתנה | | משתנה | 195 |