$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הרחבת אבות OC
- השהה מחדש PBMCs ב- α-MEM מלא (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% amphotericin B) המכיל 20 ng/mL M-CSF. PBMCs זרעים בצפיפות של 2.5 x 105 תאים / ס"מ2. בדרך כלל, תאים מבודדים מ 15-20 מ"ל דם טרי ניתן לזרוע אחד 75 ס"מ2 בקבוק (1.5-2 x 107 תאים).
- הזינו את התאים ב-α-MEM מלא טרי המכיל 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF כל שלושה ימים עד שהתאים המחוברים יגיעו למפגש הרצוי. התפוקה האופיינית היא 1.5-2 x106 תאים לבקבוק כאשר התאים נפגשים ב-95%. בדרך כלל, תקופת ההרחבה נמשכת 6 ימים.
הערה: הפוטנציאל האוסטאוקלסטוגני של המבשרים יכול לרדת עם זמן גידול ממושך.
2. השראת אוסטאוקלסטוגנזה בלוחות מצופים סידן פוספט
- כדי להקל על הידבקות התא, לדגור על לוחות מצופים סידן פוספט (CaP) עם 50 μL של FBS במשך 1 שעה באינקובטור 37 ° C.
- כדי לנתק את מבשרי OC, שטפו את הבקבוק עם PBS פעמיים כדי להסיר תאים מתים או לא דבקים. מוסיפים 4 מ"ל טריפסין (טבלת חומרים) לכל 75 ס"מ2 צלוחיות, למשך 30 דקות.
- הוסף 4 מ"ל של α-MEM מלא כדי לעצור את העיכול, לנתק בזהירות את התאים באמצעות מגרד תאים ולהעביר את התאים לתוך צינור 50 מ"ל.
- קבע את מספר התא הכולל באמצעות תא נויבאואר או דומה.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 350 x גרם. להשהות את הגלולה בכמות מספקת של α-MEM המכילה 20 ng/mL M-CSF ו-20 ng/mL RANKL כדי לקבל ריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל.
- תמיסת FBS שואפת מצלחת 96 באר מצופה CaP ופיפטה 200 μL של תרחיף תאים לכל באר (2 x 105 תאים / באר).
- לדגור על מבשרי OC לפרק הזמן הרצוי או עם הריאגנטים הרצויים הרלוונטיים לתכנון הניסוי. בדרך כלל, ניתן לראות מספר גבוה של OCs גדולים ומרובי גרעינים לאחר 6 ימים וכאשר בורות ספיגה נוצרים. הזן תאים עם מדיום α-MEM מלא טרי המכיל 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF ו-20 ננוגרם/מ"ל רנקל כל שלושה ימים.
- בסוף הדגירה, לשטוף תאים עם PBS פעמיים, לתקן עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות, ולשטוף עם PBS שוב.
- השתמש OCs קבוע ישירות עבור צביעה פלואורסצנטית או לאחסן ב 4 ° C.
3. צביעה פלואורסצנטית של OCs וציפוי סידן פוספט
- יש לדגור על התאים הקבועים עם חיץ חדירה (0.1% טריטון ב-PBS) למשך 5 דקות.
- חוטי אקטין כתמים עם 100 μL של AlexaFluor 546 מסומנים בתמיסת פלואידין ב- PBS למשך 30 דקות ושאפו את תמיסת הצביעה. הוסף 100 μL של תמיסת צביעה Hoechst 33342 (10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS) למשך 10 דקות כדי להכתים גרעינים. ניתן להשתמש גם ב- DAPI.
- ציפוי Stain CaP עם 100 μL של 10 μM calcein ב-PBS למשך 10 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולצלם תמונות.