בדיקת חמצון המצע בתאים בתרבית: בדיקת מבחנה לכימות חמצון המצע בתאים על ידי מדידת אותות רדיואקטיביים מ- CO2 לכוד

תקציר

מקור: Song, C. et al., הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם ¹⁴CO₂ Trapping. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים טכניקת כימות עבור_CO2 המשתחרר במהלך חמצון המצע באמצעות ¹⁴מצעים בעלי תווית רדיו C. ¹⁴CO₂ ששוחרר לכוד בתמיסה בסיסית ומכומת על ידי מונה נצנצים. חמצון של מצעים שונים משתנה בין רקמות ומשקף את המצב הפתופיזיולוגי של הרקמה.

פרוטוקול

השימוש בחומרים רדיואקטיביים (RAM) מחייב אישור מראש של ועדת בטיחות ייעודית בכל מוסד.

1. הכנת תמיסות מלאי ^ל-14מצעים מסומנים C

1. הכינו תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) של 4 mM על ידי ערבוב של 11 גרם BSA ו-33.1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco וניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך ~3 שעות עד להמסה מלאה של BSA. יש לחמם את תמיסת מלאי BSA באמבט מים בטמפרטורה של 70°C לפני השימוש.
2. ייבוש באוויר 50 μCi ¹⁴C-oleate (50 μCi/μmol באתנול) בבקבוקון עם מכסה סגור למשך 8 שעות במכסה מנוע RAM ייעודי. הוסף 312.5 μL של H₂O ולאחר מכן 3.5 מ"ג (11.5 μmol) של נתרן oleate. מערבבים היטב.
3. מחממים את התמיסה המתקבלת ל -70 מעלות צלזיוס באמבט מים. הוסף 0.9375 מ"ל של תמיסת מלאי BSA שחוממה מראש כדי להניב 10 mM תמיסת מלאי אולאט חם (המכילה יחס של 1:11.5 של ¹⁴C-oleate ל- oleate ללא תווית). Aliquot את פתרון המלאי ולאחסן אותו ב -20 °C לשימוש לטווח ארוך.
4. יש להשתמש ^ב-14C-גלוקוז ^ו-14C-גלוטמין מיד לאחר ההפשרה.

2. הכנת מדיום המכיל ¹⁴מצעים מסומנים C

הערה: כדי להבטיח ריכוזים אמינים של מצעי אנרגיה במדיה, יש להשתמש במדיה בהתאמה אישית עם מצעים טריים שנוספו זמן קצר לפני השימוש. כאן נעשה שימוש במדיום חיוני מינימלי (MEMα) בהתאמה אישית ללא גלוקוז, פירובט, גלוטמין, פנול אדום או סודיום ביקרבונט. עם זאת, יש לקבוע מדיום אופטימלי עבור כל סוג תא.

1. להרכיב מחדש 8.67 גרם של אבקה בינונית ב 1 L של מים מטוהרים. הוסף 2.2 גרם של סודיום ביקרבונט כדי להשיג pH של 7.4 ולסנן את התמיסה באמצעות סינון ואקום 0.22 מיקרומטר.
2. הוסף מרכיבים טריים לקבלת המדיום המלא (cMEMα) עם ריכוזים סופיים של 5.5 mM גלוקוז, 2 mM גלוטמין, 1 mM פירובט, וסרום בקר עוברי 10% (FBS). תוסף נוסף cMEMα עם 100 mM L-קרניטין ו 10 μM HEPES כדי להקל על חמצון חומצות שומן.
3. מיד לפני השימוש, הוסיפו ¹⁴מצעים עם תווית C ל-cMEMα טרי כדי ליצור מדיה חמה. כדי להפוך את התווך החם של האולאט, הוסף את תמיסת מלאי האולאט החם של 10 mM ל- cMEMα לקבלת ריכוז סופי של 100 מיקרומטר אולאט (דילול 1:100, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL).
   הערה: מלאי האולאט החם של 10 מילימטר המכיל יחס של 1:11.5 של אולאט חם: קר (ראה שלב 1.3) משמש להשגת רמה פיזיולוגית של 100 מיקרומטר אולאט כולל במדיה תוך מזעור כמות החומר הרדיואקטיבי.
4. הפוך 10 mM נייר oleate ללא תווית על ידי הוספת 24.36 מ"ג של נתרן oleate ל 2 מ"ל של H₂O באמבט מים ב 70 ° C במשך ~ 20 דקות עד מומס לחלוטין לפני ערבוב במהירות עם 6 מ"ל של 4 mM BSA תמיסת מלאי מחומם מראש ל 70 ° C. מעבירים לאמבט מים 37 ° C למשך שעה אחת ומסננים דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן ב -20 °C לשימוש לטווח ארוך.
5. כדי להפוך גלוקוז חם בינוני, להוסיף ¹⁴C-גלוקוז לריכוז סופי של 1.333 מיקרומטר (דילול 1:4,125, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL). כדי להפוך את הגלוטמין לבינוני חם, יש להוסיף ¹⁴C-גלוטמין לריכוז הסופי של 2 מיקרומטר (דילול 1:1,000, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL).
6. השלימו את המדיום החם של גלוקוז וגלוטמין עם תמיסת מלאי של 10 מילימטר של אולאט ללא תווית משלב 2.4 כדי להשיג את הריכוז הסופי של 100 מיקרומטר אולאט, זהה לזה שבמדיום החם של אולאט.

3. הכנת תאים

הערה: פראוסטאובלסטים קלווריאליים ומקרופאגים של מח עצם משמשים כאן כדוגמאות. על המשתמשים להכין את סוג התא המועדף עליהם על פי פרוטוקולים מתאימים. מטב את ריכוז collagenase II לשימוש לעיכול בניסויי פיילוט, שכן הפעילות האנזימטית עשויה להשתנות בין מגרשים שונים.

1. בידוד ותרבות של preosteoblasts calvarial
   1. יש להקריב גורי יום 3-5 (P3-5) לאחר הלידה על ידי עריפת ראשים ולהעבירם ל-DPBS קרים כקרח המכילים פניצילין-סטרפטומיצין (P/S).
   2. לחשוף את calvaria על ידי הסרת העור ורקמות רכות. אספו את האזור האמצעי על-ידי חיתוך הרקמות שמסביב מאחור לחזית ב-DPBS (איור 1A). גרד את פני השטח הפנימיים והחיצוניים של הקלבריה בעדינות באמצעות פינצטה כדי לעזור לשחרר את התאים עם העיכול הבא.
   3. הכינו תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל ותמיסה של 4 מ"ג/מ"ל של Collagenase Type II ב-DPBS וסננו כל תמיסה עם מסנן טרי של 0.22 מיקרומטר. עיכלו תחילה את הקלבריה הנקייה עם תמיסת 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז למשך 15 דקות והשליכו את תמיסת העיכול. עיכול הדגימות המנוקות בתמיסת 4 מ"ג/מ"ל קולגנאז 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם, איגום ושמירה של תמיסת העיכול.
   4. סנן את תמיסת העיכול דרך מסננות תאים של 70 מיקרומטר וצנטריפוגה את התסנין ב 300 × גרם למשך 5 דקות. השהה מחדש את גלולת התא ב- cMEMα (ראה שלב 2.2) המכיל 10% FBS ו- P/S.
   5. לספור ולזרוע את התאים ב 4 × 10⁴ תאים / ס"מ² ב 10 ס"מ צלחות. תרבית את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 3 ימים.
   6. נתק את התאים ב-37°C עם 0.25% טריפסין-EDTA. ספרו וזרעו את התאים בצלחות תרבית תאים של 24 בארות עם cMEMα המכיל 10% FBS ו- P/S ב- 7.5 × 10⁵/cm². זרעו לפחות 4 בארות לכל סוג תא לכל מצע ולפחות שלוש בארות נוספות לכל סוג תא לספירת תאים לפני הבדיקה.
   7. תרבית את התאים ב 37 מעלות צלזיוס לילה לפני בדיקות חמצון המצע.
2. בידוד ותרבות של BMMs
   הערה: תרבית של BMM דורשת גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF), אשר ניתן לרכוש באופן מסחרי כחלבון רקומביננטי. מדיום מותנה מקו התא CMG14-12 שהונדס לבטא M-CSF הוא חלופה חסכונית המשמשת כאן.
   1. אספו את עצם הירך והטיביאס מעכברים בני 8 שבועות לאחר הסרת השריר ורקמות החיבור. חותכים ומשליכים את שני קצוות העצמות במספריים חדים.
   2. יש לשטוף את מח העצם מעצם הירך האחת ומעצם השוקה האחת לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ בעזרת מזרק המצויד במחט 23 גרם המכילה 15 מ"ל cMEMα עם 10% FBS, P/S ו-10% CMG14-12 מותנה בינוני (BMM medium). תרבית את התאים בצלחת פטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   3. לאחר 3 ימים, השליכו את מדיית התרבית ושטפו עם DPBS. נתק את התאים המחוברים ב-37°C עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות. צנטריפוגה ולהשהות מחדש את גלולת התא בתווך BMM.
   4. לספור ולזרוע את התאים בצלחות תרבית תאים 24 בארות ב 7.5 × 10⁵/cm² באותו אופן כמתואר ב 3.1.6. תרבית ב 37 ° C לילה בתווך BMM לפני תחילת הבדיקות.

4. בדיקת חמצון המצע עם מלכודת CO₂

הערה: יש לקבוע צפיפות זריעה מתאימה לכל סוג תא כדי להשיג מפגש של 80-90% לפני תחילת הבדיקה. שימו לב שצפיפות התאים יכולה להשפיע על המצב המטבולי של התאים.

1. לשטוף את התאים בארות נוספות פעמיים עם DPBS. נתק את התאים עם 0.25% טריפסין-EDTA ותאים מעורבים של 20 μL המרחפים מחדש ב- DPBS עם 20 μL של תפוז אקרידין/פרופידיום יודיד (AO/PI) תמיסת צבע מסחרית מוכנה לשימוש. קבע את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי ורשום את המספר לחישובים סופיים.
2. לשטוף את התאים בארות הבדיקה פעמיים עם DPBS. הוסף 500 μL של מדיום חם לכל בדיקה היטב במכסה המנוע המיועד לתרבית רקמה המיועדת ל- RAM. אוטמים את הלוחות עם פרפילם ודגרים על התאים באינקובטור המיועד לזיכרון RAM בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
3. במהלך הדגירה, חתכו את נייר המסנן לחתיכות עגולות מעט גדולות יותר מהשטח בתוך המכסה של צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל והכניסו את הנייר בצורה נוחה לתוך הפקק (איור 1B). הוסף 200 μL של 1 M חומצה פרכלורית לכל צינור ו 20 μL של נתרן הידרוקסידי לנייר המסנן המותקן בתוך המכסה.
4. לאחר הדגירה של התאים, להעביר 400 μL של מדיום תרבית מכל באר אל צינורות מוכן לסגור את הכובעים מיד. השאירו את הצינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
5. במהלך הדגירה, להגדיר בקבוקון scintillation עבור כל צינור ולמלא אותו עם 4 מ"ל של נוזל scintillation. מעבירים כל פיסת נייר סינון לבקבוקון נצנוץ ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
6. בצע בדיקות מגבון על מכסה המנוע של תרבית הרקמות, אמבט המים (המשמש להכנת ¹⁴C-oleate), מקרר, אינקובטור, כיור, קרקע וכל אזור עבודה אחר לזיהום RAM פוטנציאלי. הכניסו את מגבוני הנייר לבקבוקוני נצנוץ המכילים נוזל נצנצים.
7. מדידת רדיואקטיביות ^{של 14}C בבקבוקוני הנצנוץ עם מונה נצנצים. רשום את תוצאות הקריאה. לטהר את סביבת העבודה בהתאם להנחיות בטיחות קרינה במידת הצורך.

תוצאות

איור 1: דיאגרמות עבור בדיקת לכידת CO₂ ודיסקציה של קלווריה. (A) האזור האמצעי של הקלבריה, המסומן על-ידי המשולש המקווקו הכתום, נקצר לצורך בידוד תאים. (B) צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל משמשים ללכידת_CO2 (שלב 1). ניירות סינון (נייר כחול למטרות המחשה) נחתכים כך שיתאימו למכסי צינור (שלב 2). הוסף 200 μL של 1 M חומצה פרכלורית ל 400 μL של מדיה חמה מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 מיקרומטר מסננים	סיגמא-אולדריץ'	SLGVM33RS	משמש לסינון תמיסת BSA
0.25% טריפסין-EDTA	גיבקו	25200056	ניתוק תאים מתרכובת תאים צלחות
1.5 מ"ל צינורות אפנדורף	PR1MA	יח"צ MCT17 RB	משמש לדגירת תגובה
פלטות בקוטר 10 ס"מ	TPP	93100	משמש לתרבית תאים
מזרק 10 מ"ל	ב.ד.	302995	משמש לשטיפת מח מוח מ- long עצמות
10% FBS	אטלנטה ביולוגים	S11550	להכנת מדיום תרבית תאים
14C -גלוקוז	פרקיןאלמר	NEC042X050UC	משמש להכנת מדיה חמה
14 C-גלוטמין	פרקיןאלמר	NEC451050UC	משמש להכנת מדיה חמה
14 C-oleate	פרקיןאלמר	NEC317050UC	משמש להכנת מדיה חמה
23 גר' מחט	ב.ד.	305120	משמש לשטיפת מח מוח מ- long עצמות
צלחות 24 בארות	TPP	92024	משמש לתרבית תאים
מסננות תאים 70 מיקרומטר	MIDSCI	70תא	משמש לסינון supernatant במהלך עיכול קווארי
Acridine תפוז/Propidium יודיד (AO/PI) צבע	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	כתמים תאים חיים כדי לקבוע זרע צפיפות
סרום בקר Ablumin	Proliant Biologicals	68700	משמש לצמידות חומצות שומן
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		קביעת מספר התאים בני קיימא
צנטריפוגה	תרמו פישר	מקרא מיקרו 21R	משמש לתאי גלולה
קולגנאז סוג II	וורטינגטון	LS004176	ניתוק תאים מהרקמה
אלפא MEM מותאם אישית	גיבקו	מק"ט: ME 18459P1	משמש ליצירת מדיה חמה מותאמת אישית
Dulbecco's Phosphate-Buffered מלוחים	גיבקו	10010023	משמש להמסת ודילול ריאגנטים, ולשטוף כלי תרבות
נייר סינון	מיליפור-סיגמא	WHA1001090	מלכוד CO2 עם נתרן הידרוקסידי
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G7528	משמש ליצירת מדיה מותאמת אישית
HEPES	גיבקו	15630080	לוכד CO2 במהלך תרבית תאים
ל-קרניטין	סיגמא-אולדריץ'	C0283	תוסף לחמצון חומצות שומן
ל-גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'	G3126	משמש ליצירת מדיה מותאמת אישית
MEM אלפא	תרמו	A10490	מדיום תרבית תאים
פארפילם	Pecheney אריזות פלסטיק	PM998	משמש לאיטום כלים לתרבית תאים
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמו פישר	15140122	מונע זיהום בתרבית תאים
חומצה פרכלורית	סיגמא-אולדריץ'	244252	משחרר CO2 במהלך חילוף חומרים בדיקת מעבדה
פירובט	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 5280	משמש ליצירת מדיה מותאמת אישית
מונה הנצנצים	בקמן קולטר	LS6500	קובע רדיואקטיביות מה נייר סינון
נוזל נצנוץ	MP Biomedicals	882453	לספוג את האנרגיה הנפלטת על ידי RAMs ולפלוט אותו מחדש כהבזקי אור
בקבוקון נצנוץ	פישר סיינטיפיק	03-337-1	מיכלי תגובה עבור scintillation נוזל
נתרן פחמתי	סיגמא-אולדריץ'	S5761	מאגר איזון לבינוני
נתרן הידרוקסידי	סיגמא-אולדריץ'	58045	לוכד CO2 במהלך בדיקת metaboilc
נתרן אולאט	סנטה קרוז	SC-215879	חומצת שומן מצומדת BSA הכנה
סינון Vaccum 1000	TPP	99950	סנן cMEMα