$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE
1. הכנת LED לתאורת אור כחול
- הפעל לוח LED באמצעות היישום המשויך המותקן בטאבלט/טלפון. הכנס את הגשושית של ספקטרומטר לבאר ריקה של צלחת 6 בארות והתאם את אור ה- LED לאורך הגל שהגיע לשיא של ~ 456 ננומטר באמצעות היישום. מקם את החיישן האופטי של מד חשמל אופטי בבאר הריקה וכוונן את עוצמת נורית ה- LED (~ 0.61 mW / cm2). ניתן לשמור את הגדרת נורית ה- LED והיא ניתנת לאחזור ביישום.
- הציגו את הגדרת לוח הכלים/LED לאינקובטור ב-28°C. סיימו שלב זה לפני שההדמיה של דגים תתחיל ב-48 hpf.
2. הדמיה של זחלי דגי זברה המבטאים TDP-43 אופטוגנטי
- בחר Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דג מהונדס כפול לפחות לפני 47 hpf, בהתבסס על RFP (opTDP-43h) או EGFP (EGFP-TDP-43z) פלואורסצנטיות בעמוד השדרה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בעדשה אובייקטיבית Plan-Neofluar 5x/0.15.
- Dechorionate את Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים טרנסגניים כפולים.
- מחממים מראש אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה של 1% המכיל 250 מיקרוגרם/מ"ל מלח אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט ב-42°C.
- הרדמה קצרה Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] דג מהונדס כפול ב 48 hpf ב E3 חיץ המכיל את אותו ריכוז של טריקן.
- שים טיפה של טמפרטורת התכה נמוכה 1% שחומם מראש על צלחת בסיס זכוכית בטמפרטורת החדר. קוטר טיפת האגרוז בצורת כיפה על צלחת הזכוכית הוא 8-10 מ"מ.
- בעזרת פיפטה של פסטר, מוסיפים את הדג המורדם לטמפרטורת ההתכה הנמוכה על צלחת בסיס הזכוכית, ואז מערבבים על ידי פיפטינג כמה פעמים. מזערו את כמות חיץ E3 שנוסף לאגרוז יחד עם הדג.
- שמור על הדג על צדו באמצעות מחט מזרק במהלך התמצקות האגרוז (בדרך כלל ~ 1 דקות) כדי להבטיח שחוט השדרה נמצא במצב אופקי מתאים. לאחר ההתמצקות, הניחו כמה טיפות של חיץ E3 על דג האגרוז בצורת כיפה.
- קבל חתכי z קונפוקליים סדרתיים של חוט השדרה על ידי סריקה במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשת אובייקטיבית טבילת מים 20x עם צמצם מספרי 1.00, באמצעות מהירות סריקה של 4.0 μs לפיקסל (12 סיביות לפיקסל), גודל צעד של 1.0 מיקרומטר לפרוסה עבור המטרה, ושילוב של אורכי גל עירור/פליטה: ערוץ 1) 473/510 ננומטר עבור EGFP וערוץ 2) 559/583 ננומטר עבור mRFP1.
הערה: הקלואקה בצד הגחוני של הדג נכללת באזורי העניין (ROI) כהפניה, המסייעת לזהות ולהשוות את מקטעי עמוד השדרה (רמות 16-17) על פני נקודות הזמן.
- הסר את הדג מן agarose על ידי פיצוח בזהירות agarose עם מחט מזרק ברגע ההדמיה הושלמה. הקפידו על משך זמן קצר ככל האפשר להטמעת הדג באגרוז, אם כי הטבעה של האגרוז במשך <30 דקות אינה משפיעה על יכולת הקיום של הדג.
3. גירוי אור של דגים המבטאים opTDP-43h על ידי הארת שדה של אור דיודה פולטת אור כחול (LED)
- הוסף 7.5 מ"ל של חיץ E3 לבאר ומקם את Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דג מהונדס כפול לתוך הבאר. הניחו את צלחת שש הבארות על לוח הלד על ידי שמירה על הצלחת ולוח הלד במרחק של 5 מ"מ זה מזה באמצעות ספייסר (לדוגמה, עם חמש כוסות שקופיות בערימה).
- הפעל את נורית ה- LED הכחולה. שמור חלק Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים טרנסגניים כפולים בצלחת נפרדת בת שש בארות מכוסה ברדיד אלומיניום כאשר יש צורך בדגי בקרה לא מוארים (כלומר, בתנאים חשוכים).
- לאחר ההארה (למשל, במשך 24 שעות ב-72 HPF באיור 1), דמיינו את חוט השדרה של הדג המואר על-ידי חזרה על השלבים 2.3-2.9.
