כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE
1. מסך מולקולה קטנה במבחנה
- הכינו את לוחות הבדיקה לפי השלבים הבאים.
- יוצקים מים מזוקקים אוטוקלאביים לתוך שוקת סטרילית, ובאמצעות פיפטה רב ערוצית, פולטים 40 מיקרוליטר מים מזוקקים מהשוקת לכל באר של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות.
- הכינו את כלי ההצמדה והוסיפו את הכימיקלים.
- הציבו מגשי פינר (ראו טבלת חומרים) ליד להבת מבער בונזן על ספסל במעבדה. הוסף את הפריטים הבאים למגשי פינרים עוקבים: 25 מ"ל של תמיסת ניקוי פינים, 35 מ"ל של 50% DMSO (במים), 45 מ"ל של מים מזוקקים, 55 מ"ל של 70% EtOH ו-65 מ"ל של 95% EtOH. הניחו פיסת נייר ניקוי אחת לפני כל מגש.
- נקו את כלי ההצמדה על ידי הכנסת הפינים לתמיסת הניקוי והזזת הפינים למעלה ולמטה שלוש פעמים (פי 3) בתמיסה. בפרוטוקול זה, '3x' ו- '10x' מוגדרים כהזזת הסיכה למעלה ולמטה בתמיסה שלוש או עשר פעמים, בהתאמה. כתם את הסיכות על נייר הניקוי. חזור על הליך זה פעם נוספת.
- לאחר מכן, שטפו את הפינים 3x במים מזוקקים, ולאחר מכן כתם את הפינים. חזור על ההליך פעם נוספת.
- לבסוף, שטפו את הפינים 3x ב-95% EtOH, ולאחר מכן שטפו את הפינים. חזור על הפעולה פעם נוספת. להבעיר את הסיכה ולאפשר אתנול להתאדות.
- הוסף כימיקלים מלוחות מלאי כימיקלים של 96 בארות ללוחות הבדיקה על ידי הצמדת 3x לצלחת הכימית, ולאחר מכן העברת הפינים 10X לצלחת הבדיקה. כתם על נייר מול תמיסת הניקוי.
- יש לנקות את כלי ההצמדה בין הצלחות על ידי שטיפה בסדר הבא, בין לבין על נייר ניקוי: 3x ב-50% DMSO (פעם אחת), 3x במים מזוקקים (פעם אחת), 3x ב-75% EtOH (פעם אחת), 3x ב-95% EtOH (פעמיים). להבעיר את הסיכה ולאפשר אתנול להתאדות.
- חזור על שלב 1.2.2 לאחר השלמת כל ההצמדות.
הערה: הבדיקה בוצעה בריכוז סופי של 60 מיקרומטר.
- תוספת של תולעים
- ספור את מספר הנמטודות מהאוסף על ידי השעיה מחדש ולאחר מכן פיפטציה של 5 μL באמצעות קצוות שמירה נמוכים על שקופית לתצפית. ספרו את מספר הנמטודות ב-5 μL באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה.
- יש לכוונן את הריכוז ל-2 תולעים/μL באמצעות מים מזוקקים סטריליים. בעזרת פיפטה רב ערוצית ושוקת, מוסיפים 10 μL (~ 20 תולעים) לכל באר של לוחות 96 בארות.
הערה: כ-15,000 נמטודות D. dipsaci ייאספו לכל צלחת תרבית בשיטת התרבית והאיסוף המתוארת. עשרים תולעים משמשים לכל באר כי מספר קטן מאפשר הדמיה ברורה חשבונאות של ניידים אלה ניידים.
- אוטמים את הצלחות בסרט עטיפה במעבדה ועוטפים במגבת נייר לחה. יש להכניס לקופסה ולהדביק על פד דביק באינקובטור ניעור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד. ודא כי הצלחות מיוצבות בקופסה על ידי הוספת מגבת נייר לחה נוספת כדי להבטיח תנועה מינימלית של הצלחות.
2. איסוף נתונים וניתוחם
- צפו בצלחות ביום 5 תחת מיקרוסקופ מנתח. ספור את מספר הנייד ואת המספר הכולל של D. dipsaci בבקרות ממס DMSO ובארות מטופלות בתרופות.
- אם התולעים אינן ניידות יחסית, הוסף 2 μL של 1 M NaOH לריכוז סופי של 40 mM לבאר כדי לעורר תנועה.
הערה: לאחר הוספת NaOH, התולעים ינועו באופן מיידי ויש לצפות בהן תוך 5 דקות. מספר התולעים הניידות והמספר הכולל של התולעים ישמשו לחישוב חלקם של תולעים ניידות. אורך הבדיקה עשוי להשתנות בהתאם למטרה של המסך.
- חשב את חלקם של תולעים ניידות. במסכי D. dipsaci, בארות שהניבו 0% תולעים ניידות מסווגות כפגיעות חזקות.
הערה: נמנעת חשיפה ממושכת של לוחות על במת מיקרוסקופ דיסקציה מכיוון שמקור האור יכול לחמם את הלוחות ולגרום להשפעות משתנות על הביואסיה.
