מאמר שיטה

בדיקת מינרליזציה חוץ גופית: שיטה קולורימטרית לכימות משקעי סידן אוסטאובלסטים על תחליף שתל עצם על ידי צביעה ומיצוי של Alizarin Red S

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Kampleitner, C. et al. פרופיל תאימות ביולוגית על ביו-חומרים להתחדשות עצם. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה אנו מתארים שיטה לזיהוי משקעי סידן המופרשים על ידי אוסטאובלסטים באמצעות צבע אניוני, Alizarin Red S. האוסטאובלסטים המתורבתים מוכתמים תחילה ולאחר מכן מחזירים את הצבע לצורך כימות קולורימטרי של משקעי סידן או מידת מינרליזציה של אוסטאובלסט.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקת מינרליזציה אוסטאובלסט

  1. קדם-דגירה של דיסקים בקוטר 14 מ"מ β-טריקלציום פוספט (β-TCP) ב-1 מ"ל של מדיום צמיחת עצם (BGM) בלוח תרבית תרחיף של 24 בארות ב-37°C ו-5% CO₂ למשך 24 שעות לפני הוספת האוסטאובלסטים (OBs). השתמש בצלחות תרבית רקמה סטנדרטיות לבקרות ולוחות תרבית תרחיף עבור דגימות החומר הביולוגי כדי למנוע היצמדות תאים לפלסטיק.
  2. שאפו את המדיום שלפני הדגירה ולאחר מכן השעו מחדש את OBs העכבר הראשי ב- BGM. הוסף 8.8 x 10⁴ OBs/cm² לדיסקים β-TCP המודגרים מראש בלוח תרבית מתלה של 24 בארות ולקבוצת הביקורת, לצלחת תרבית רקמה של 24 בארות (1 מ"ל/באר). OBs יתחברו לצלחת תרבית הרקמה או לדגימת החומר הביולוגי.
  3. החלף את ה- BGM ב- 1 מ"ל של מדיום מינרליזציה אוסטאוגנית (MM) המכיל BGM, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, ו- 5 מ"מ β-גליצרופוספט 24 שעות לאחר הוספת ה- OBs ודגר במשך 14 יום ב- 37 ° C ו- 5% CO₂. שנה את המדיום כל 2-3 ימים עם 1 מ"ל של MM מוכן טרי לכל באר.

2. מינרליזציה אוסטאובלסט מוערכת על ידי צביעה עם Alizarin Red S (ARS)

  1. שאפו את מדיום התרבית מהבארות המכילות OBs ראשוניים 14 יום לאחר הוספת MM ושטפו פעמיים עם 0.5 מ"ל של 1x PBS ב- RT. שאפו את PBS וקבעו את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת פורמלין חוצצת 10% ב- RT למשך 10 דקות.
  2. שאפו את הפורמלין החוצץ 10% עם צינור חד פעמי ושטפו פעמיים עם 0.5 מ"ל מים טהורים במיוחד.
  3. ל-OBs הקבועים, הוסיפו 0.25 מ"ל של תמיסת צביעת ARS של 40 mM (pH 4.2) מומסת במים אולטרה-טהורים ודגרו על הצלחת ב-RT למשך 10 דקות על שייקר ב-100 שייקים לדקה.
  4. שאפו את תמיסת הצביעה עם צינור חד פעמי ושטפו עם 1 מ"ל מים טהורים במיוחד. חזור על שלב זה 5-10 פעמים כדי להסיר כתמים לא ספציפיים.
    הערה: פתרון השטיפה צריך להיות ללא צבע.
  5. שאפו את המים האולטרה-טהורים והוסיפו 1 מ"ל של PBS קר. דוגרים על הצלחת ב-RT במשך 10 דקות על שייקר ב-100 שייקים לדקה.
  6. שאפו את ה-PBS, העבירו את דיסקי ה-β-TCP המוכתמים לבאר חדשה, וסרקו את הלוחות באמצעות סורק שטוח כדי להקליט מינרליזציה.
  7. הוסף 0.25 מ"ל של תמיסת 10% צטילפירידיניום כלוריד ודגר על הצלחת ב- RT למשך 15 דקות על שייקר במהירות של 100 שייקים לדקה כדי לחלץ את צבע ARS.
  8. העבר את הסופרנאטנטים לצינור 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות 17,000 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
  9. הוסף 10% תמיסת צטילפירידיניום כלוריד לתמציות עם יחס דילול של 1:10-1:20 והוסף את הדגימות (300 μL) לצלחת של 96 בארות כולל שתי בארות ריקות המכילות רק 10% צטילפירידיניום כלוריד
    10. .
  10. הכן 7 תקני ייחוס ARS הנעים בין 4 ל -400 מיקרומטר על ידי דילול תמיסת צביעת ARS 40 mM (pH 4.2) עם תמיסת 10% צטילפירידיניום כלוריד ליצירת עקומה סטנדרטית.
  11. הוסף 300 μL של תקן הייחוס בכפילויות לצלחת 96 בארות.
  12. קרא את ספיגת הדגימות, החסר ותקני הייחוס ב- 520 ננומטר.
  13. החסר את הקריאות הריקות מתקני הייחוס ומהקריאות לדוגמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דיסקים β-טריקלציום פוספט (β-TCP, 14 מ"מ)דיסקים היו מסונטרים בכבשן עמום בטמפרטורה של 1150 מעלות צלזיוס. הדגימות היו מוקרנות UV (15 דקות לכל צד) לפני השימוש בתרביות תאים
אליזרין אדום Sסיגמא-אולדריץ'A5533
מדיום צמיחת עצם (BGM)α-MEM + 10% FBS מומת חום + 1% פניצילין/סטרפטומיצין
תמיסת פורמלין ניטרלי חוצץ 10%סיגמא-אולדריץ'HT501128
הקסדצילפירדיניום (cetylpyridinium) כלוריד מונוהידראטסיגמא-אולדריץ'C9002
L-חומצה אסקורבית 2-פוספט ססקווימגנזיום מלח הידרטסיגמא-אולדריץ'A8960
MEM אלפא בינוני (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
מדיום מינרליזציה אוסטאוגנית (MM)α-MEM + 10% FBS מומת חום + 1% פניצילין-סטרפטומיצין + 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית + 5 מ"מ β-גליצרופוספט
פניצילין-סטרפטומיצין סיגמא-אולדריץ'עמ' 4333
מלח חוצץ פוספט 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
β-גליצרופוספט דיסודיום מלח הידרטסיגמא-אולדריץ'G5422
מים טהורים במיוחד: מים תרבית תאים ללא פירוגןVWRL0970-500
צלחת שקופה 96 בארותגריינר ביו-וואן655001
צלחת תרבית מתלה 24 בארותגריינר ביו-וואן662102
צלחת תרבית רקמות 24 בארותגריינר ביו-וואן662160
צנטריפוגה: VWR מגה סטאר 600RVWR
CO2-אינקובטור: HeraCell 240תרמו סיינטיפיק
סורק שטוח: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
קורא מיקרו-צלחות אינסופי M200 Proטקאן
צינור מיקרוצנטריפוגה: מנעול כספת צינור אפנדורף 1.5 מ"לVWR21008-959
טלטול האינקובטור GFL3032GFL 3032
פיפט חד פעמי: פיפט בסרוםגריינר ביו-וואן612301

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים