1. הכנת חרוזים להשתלת ג'ל
- קח תרבית המכילה חרוזי מיקרו-נשא המצופים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVEC) ופריציטים.
- בחנו את הכלים המכילים את החרוזים המצופים במיקרו-נשא תחת המיקרוסקופ באמצעות המטרה 20X כדי לוודא שכל החרוזים צופו מספיק על ידי תאי אנדותל.
- פיפטה נמרצת של תמיסה מצופה של תאים לנתק אותם מן הצלחת 6 ס"מ ומניחים את התמיסה לתוך צינור. שטפו את הצלחת פעמיים נוספות עם מדיה מלאה והעבירו לצינור כדי לאסוף את כל שאריות החרוזים שניתן להדביק לצלחת.
- הימנעו מהחדרת בועות אוויר והשתמשו בפיפט p1000 כדי למזער את לחץ הגזירה על החרוזים המצופים בתאי אנדותל.
- המתן 3 דקות כדי לאפשר לחרוזים בתמיסה לשקוע לתחתית הצינור.
- מוציאים כמה שיותר מהסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולת החרוז בעזרת קצה פיפטה p1000 (אין להשתמש בשואב ואקום).
- הוסף 1 מ"ל של מדיה שלמה לכל צינור והשהה מחדש את החרוזים.
- המתן 30-60 שניות כדי לאפשר לחרוזים לשקוע לתחתית. לאחר מכן הסר כמה שיותר מהסופרנאטנט באמצעות פיפטה P1000 מבלי להפריע לגלולת החרוזים. אין להשתמש שואב ואקום כמו הסבירות של הסרת בטעות את כדור החרוז גדל מאוד.
- חזור על שלבים 1.6 ו- 1.7 פעמיים נוספות. המטרה היא להסיר כמה שיותר מה-HUVEC הצף בחופשיות שאולי נותק מהצלחת בקוטר 6 ס"מ, מבלי להסיר יותר מדי חרוזים מצופים HUVEC, שאמורים להתיישב בצינורות מיון התאים המופעלים פלואורסצנטיים (FACS) בעלי תחתית עגולה מהר יותר מאשר תאים צפים חופשיים.
- הוסף 1 מ"ל של מדיה מלאה לחרוזים.
2. שיבוץ חרוזים מצופים בג'ל פיברין
- הסר מדיה רבה ככל האפשר מבלי להפריע לגלולת החרוזים בכל שפופרת FACS באמצעות פיפטה P1000.
- להשעות את החרוזים ב 2.5 מ"ל של פתרון פיברינוגן.
- פיפטה 13 μL של תמיסת טרומבין לתוך כל באר הרצויה של צלחת 24 באר עם תחתית זכוכית. ציפוי בצלחת בעלת תחתית זכוכית חיוני כדי לאפשר הדמיה אופטימלית של הנבטים.
הערה: אין להשאיר טרומבין יושב בבאר במשך יותר מ 5-10 דקות לפני השלב הבא.
- הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת חרוזים/פיברינוגן לכל באר.
- הקפד להשהות מחדש את תמיסת החרוזים הרבה לפני הפיפט של התמיסה בכל פעם.
- היזהר בזהירות פיפטה ישירות לתוך טרומבין כבר נוכח בבאר. לאט פיפטה למעלה ולמטה 2-3 פעמים כדי לערבב היטב את התמיסה, תוך זהירות לא להכניס בועות אוויר.
- הקפד להחליף את קצה פיפטה בין בארות.
- יש להיזהר שלא להזיז או להפריע לצלחת בשום שלב במהלך קרישת הפיברין הראשונית, שכן כל תזוזה עלולה לשבש את היווצרות הג'ל.
- השאירו את הצלחת מונחת במכסה המנוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- מעבירים בזהירות את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5-2 שעות נוספות כדי לאפשר לג'ל להתמצק במלואו
3. ציפוי פיברובלסטים על גבי ג'ל הפיברין
- במהלך 30 הדקות האחרונות של התמצקות הג'ל, נתק פיברובלסטים ריאתיים אנושיים רגילים (NHLF) באופן הבא:
- יש לשטוף בקבוק T175 של תאים עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן להוסיף 5 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים ולדגור ב 37 ° C במשך 10 דקות.
- השהה מחדש NHLF בריכוז של 20,000 תאים/מ"ל במדיה מלאה.
הערה: ניתן לגדל תאי NHLF בתרבית עם Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% סטרפטומיצין פניצילין.
- צלחת 1 מ"ל של תרחיף תאי NHLF על הג'ל של כל באר ומניחים אותו בחזרה באינקובטור.
- החליפו מדיה מלאה אחת ליומיים למשך תקופת הבדיקה.
