בדיקת מגע זחלים: הליך להערכת תמותת זחלי יתושים בעקבות מגע ישיר עם תרכובת זחלי בדיקה

תקציר

מקור: Brito-Sierra, C. A., et al. פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של קוטלי חרקים חדשים ליתושים J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מתארים את בדיקת מגע הזחל כדי להעריך את הרעילות של אנטגוניסט קולטן דופמין amitriptyline על זחלי השלב השלישי instar של יתושים, וקטורים ידועים של כמה מחלות זיהומיות בבני אדם. הערכת תמותת הזחלים בעת הדגירה עם ריכוזי אמיטריפטילין שונים על פני מרווחי זמן שונים מסייעת לקבוע את ריכוזו הקטלני 50.

פרוטוקול

1. בדיקת מגע זחל (מנה נקודתית בודדת או בדיקת תגובת מינון)

הערה: הבדיקה יכולה להתבצע עם כימיות המסיסות במים או דימתיל סולפוקסיד (DMSO), בתנאי שהריכוז הסופי של DMSO בבארות הבדיקה אינו עולה על 1%. ממסים חלופיים עשויים להיות אופציה, אך חיוני לאשר תחילה כי הריכוז הסופי אינו גורם לתמותה של יותר מ -10% לאחר 72 שעות לאחר החשיפה. הבדיקה יכולה להתבצע כמינון נקודתי יחיד או בדיקת מנה-תגובה. אם מבצעים את האחרון, מומלץ לבדוק טווח ריכוזים (מינימום חמישה), המשתרע על LC₅₀ הצפוי.

1. תייגו את הבארות של צלחת רקמה שקופה בת 24 בארות.
2. הכינו תמיסת מלאי של כימיית הבדיקה בצינור של 1.5 מ"ל.
   1. לשקול כל כימיה באמצעות איזון אנליטי, ובהתאם למאפייני מסיסות, להשהות מחדש ב ddH₂O, DMSO, או ממס אורגני מתאים אחר לפי בחירה.
      הערה: חישובים צריכים לקחת בחשבון את טוהר הכימיה. לדוגמה, עבור כימיה טהורה ב-99%, יש להמיס 10.1 מ"ג ב-1,000 מיקרוליטר אצטון כדי לקבל תמיסה של 1%. חותם עם סרט פרפין ולאחסן ב -20 ° C.
3. לקבוע את הריכוז הסופי של כימיית הבדיקה שתוערך ולהכין דילולים סדרתיים מתמיסת המלאי בהתאם, תוך שימוש בממס המתאים.
   הערה: ניתן לחשב את הריכוז והנפח של כימיה וממס באמצעות הנוסחה C1*V1=C2*V2 כאשר C1=ריכוז מדגם 1, C2=ריכוז מדגם 2, V1=נפח מדגם 1 ו-V2=נפח מדגם 2.
   1. הכינו תמיסת מלאי של 10 מילימטר ודילולים סדרתיים כנדרש להשגת ריכוזי הבדיקה הרצויים (טבלה 1B).
4. באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק רחבה, מעבירים חמישה זחלי L3 לבאר של צלחת בדיקה של תרבית רקמות; ניתן לזהות זחלי L3 לפי אורך (~ 2.5 - 3.5 מ"מ) ורוחב קפסולת ראש של ~ 0.025 מ"מ. מוציאים בעדינות את המים עם פיפטה של 1 מ"ל ומחליפים אותה בנפח הרצוי של ddH₂O. חזור על הפעולה לקבלת n = 4 עותקים טכניים לכל טיפול (כלומר, 20 זחלים בסך הכל בכל טיפול).
5. הוסף את הנפח המתאים של כימיית הבדיקה לכל אחת מארבע הבארות המשוכפלות בלוח הבדיקה בן 24 הקידוחים וסובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ערבוב כימי אחיד. הניחו את הצלחת בתא בדיקה או גדילה בתנאים קבועים (למשל, מומלץ 25°C ו~ 75-85% לחות יחסית, ומחזור אור של 12 שעות/12 שעות חושך במידת האפשר).
   הערה: לצורך שחזור בין ניסויים, ודא שהבדיקות הבאות מבוצעות באותם תנאים סביבתיים.
6. רשום את מספר הזחלים המתים/לא מגיבים בכל באר ב-30 דקות, 1, 1.5, 2, 3, 24, 48 ו-72 שעות לאחר החשיפה (או נקודות זמן חלופיות) בגיליון הניקוד (טבלה 2). טפחו בעדינות על צד הצלחת. אם לא נצפתה תנועה, גע בעדינות בזחל עם קיסם סטרילי. ציון זחלים שאינם מגיבים להקשה/מגע כ"מתים".
   הערה: ניתן לצפות בפנוטיפים מורפולוגיים והתנהגותיים אחרים וניתן לתעד אותם.
7. נכון לבקרת תמותה באמצעות נוסחת אבוט ששונתה אם תרצה, באופן הבא:
   תמותה (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
   כאשר X = אחוז התמותה במדגם שטופל, ו- Y = אחוז התמותה בביקורת.
8. גרף מתקבל כהיסטוגרמה או עקומה לוגריתמית באמצעות תוכנה לבחירה כגון Graph-pad Prism 6 או דומה ומחשב ערכי ריכוז קטלני (LC) ביחס לביקורת.
9. חזור על הבדיקה באמצעות קבוצה נפרדת של יתושים כדי לקבל n = 3 או יותר עותקים ביולוגיים.

טבלה 1. חישובים לדוגמה עבור זחל Aedes aegypti L3 (A) בדיקת מינון נקודה בודדת ו- (B) בדיקת מנה-תגובה.

A. בדיקות מינון נקודתיות בודדות עם שלוש כימיות
כימיה	ריכוז (400 uM)
Amitriptyline	80 mM מלאי: 2 מ"ג amitriptyline X 98% (טוהר האבקה) X 0.001 גרם/1 מ"ג X 1 מול /313.86 גרם X 1 L/0.08 mol X 106 μL/L = 78.06 μL מים.
	דילול סדרתי: דילול מלאי 1:2 עם ddH2O ולאחר מכן 1:4 להשגת 10 mM. הוסף 40 μL של מלאי 10 mM לבאר המכילה 960 μL של ddH20 כדי להשיג ריכוז סופי של 400 μM / באר. הכן דילולים סדרתיים של מלאי 10 מ"מ ביחס 1:2 להשגת מלאי של 5 מ"מ, 2.5 מ"מ, 1.25 מ"מ ו-0.625 מ"מ.
Cis-(z)-flupenthixol	80 mM מלאי: 2 מ"ג של cis(z)flupenthixol X 98% (טוהר האבקה) X 0.001 גרם/1 מ"ג X 1 mol/507.44 גרם cis(z)flupenthixol X 1L/0.08 mol X 106 μL/L = 48.28 μL מים.
	דילול סדרתי: כנ"ל.
Amitraz	80 mM מלאי: 2 מ"ג של Amitraz X 0.001 גרם/1 מ"ג X 1 mol/293.4 גרם של amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 μL/1 L = 85.21 μL של DMSO (הערה: Amitraz מסיס רק ב-DMSO).
	דילול סדרתי: כנ"ל.
B. בדיקת מנה-תגובה
כימיה	מנה 1	מנה 2	מנה 3	מינון 4	מנה 5
	400 מיקרומטר	200 מיקרומטר	100 מיקרומטר	50 מיקרומטר	25 מיקרומטר
למשל Amitriptyline, cis-(Z)-flupenthixol oramitraz	40 מיקרוליטר	40 מיקרוליטר	40 מיקרוליטר	40 מיקרוליטר	40 מיקרוליטר
	10 מ"מ מלאי	5 מיליון מניות	2.5 מיליון מלאי	1.25 מ"מ למלאי	0.625 מ"מ למלאי

טבלה 2. גיליון ציונים לדוגמה המשמש לרישום נתונים מבדיקת התגובה למינון של זחלי יתושים. בקרה, מים בלבד או מים עם 1% DMSO או ממס אחר בלבד. מינונים אופייניים המשמשים לבדיקת כימיה אנטגוניסטית של מולקולות קטנות כגון amitriptyline הם 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM ו- 400 μM.

Mosquito L3 בדיקת זחל
תאריך הפעלה:
חוקר:
מין/זן:
סוג מבחן: מנה נקודתית/תגובת מנה בודדת
תמותה (לא. יתושים מתים)
שעה (שעות)	מנה 1	מנה 2	מנה 3	מינון 4	מנה 5	לשלוט
0.5
1
1.5
2
2.5
3
12
24
48
72
אחוז תמותה
שעה (שעות)	מנה 1	מנה 2	מנה 3	מינון 4	מנה 5	לשלוט
0.5
1
1.5
2
2.5
3
12
24
48
72

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זני יתושים רגישים לקוטלי חרקים	מחקר מלריה ומאגר ייחוס מגיבים		https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; מומלץ זנים: זן Aedes aegypti Liverpool (LVP), Anopheles gambiae זן קיסומו (KISUMU1) וזן Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB)
אצטון	Mallinckrodt כימי	CAS 67-64-1	שימוש לדילול ובקרה
אמיטרז	סיגמא-אולדריץ'	CAS 33089-61-1	דורש דילול ב-DMSO
אמיטריפטילין	סיגמא-אולדריץ'	CAS: 549-18-8	ניתן לדלל באצטון
Cis-(Z)-flupenthixol	סיגמא-אולדריץ'	CAS: 51529-01-2	נבדק פרמקולוגית כמשבש קולטנים דמויי DOP
דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	MKBF2985	ממס אורגני המשמש להמסת אמיטרז
צלחת תרבית תאים 24 בארות עם מכסה	קורנינג מאוגדת	3526
העברת פיפטות	פישר סיינטיפיק	13-711-7 מ'	משמש למיון זחלים
מיקרוסקופ סטריאו	אולימפוס	SZ6045	משמש לניקוד מבחני זחל ולביצוע מיקרו-יישומים