$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE
1. תרבות של יתושים מבוגרים
הערה: זנים רגישים לקוטלי חרקים של יתושים זמינים ממאגר המחקר וההתייחסות למגיבים של מלריה. הזנים המומלצים הם כדלקמן: זן Aedes aegypti Liverpool (LVP), זן Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) וזן Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- תרבית זחלי יתושים מביצים במחזור לילה של 12 שעות / 12 שעות ב 28 ° C ו 75-85% לחות יחסית (RH) במגשי פלסטיק 25 ס"מ x 40 ס"מ (~ 400 זחלים למגש) כמתואר על ידי נוס. האכילו את הזחלים בגרביל טחון (A. aegypti ו-An. gambiae) או במזון דגים פתיתים (C. quinquefasciatus). לבדיקת הזחלים, אספו את הזחלים בשלב האינסטאר השלישי של הזחל (L3).
- יתושים בוגרים אחוריים מגלמים שהועברו לכוסות פלסטיק ומניחים בתוך כלובי פלסטיק 20 ליטר בחרק בתנאים שתוארו לעיל. שמרו על יתושים על תמיסת 20% סוכר כמתואר במקום אחר. לאסוף מבוגרים ב 3-5 ימים לאחר הופעה.
2. בדיקה מקומית למבוגרים (מינון נקודתי יחיד או בדיקת תגובת מינון)
הערה: הבדיקה האקטואלית למבוגרים מתבצעת באמצעות אצטון כממס. ממסים חלופיים עשויים להיות אופציה, אך חיוני לאשר תחילה כי הריכוז הסופי אינו גורם לתמותה של יותר מ -10% לאחר 48 שעות לאחר החשיפה. הבדיקה יכולה להתבצע כמינון נקודתי יחיד או בדיקת מנה-תגובה ומשמשת לקביעת מינון קטלני (LD). אם מבצעים את האחרון, מומלץ לבדוק טווח של ריכוזים (מינימום של חמישה), המשתרע על LD50 הצפוי.
- קבע את מספר נקבות היתושים הבוגרות הדרושות להשלמת הבדיקה.
הערה: בדיקת מינון נקודתי עם כימיה אחת תדרוש מינימום של 90 יתושים (30 עבור הבקרה החיובית, 30 עבור הבקרה השלילית של אצטון בלבד, ו -30 עבור הכימיה של הבדיקה).
- תרבו נקבות יתושים בוגרות בנות 3 עד 5 ימים ועברו לדלי פלסטיק נפרד של 20 מ"ל באמצעות שואב (איור 1).
- יש לסמן כוסות נייר במשקל 900 מ"ל עם השם והריכוז של הכימיה של הבדיקה. הניחו בצד ריבועי רשת בגודל 10X10 ס"מ וגומיות לכל (ראו איור 2).
- בחר קוטל חרקים קיים כהדברה חיובית (למשל, פירתרואיד סינתטי, bifenthrin) והכן תמיסת מלאי 1% (10 מיקרוגרם / μL) באצטון.
הערה: חישובים צריכים לקחת בחשבון את טוהר הכימיה. לדוגמה, עבור כימיה טהורה ב-99%, יש להמיס 10.1 מ"ג ב-1,000 מיקרוליטר אצטון כדי לקבל תמיסה של 1%. חותם עם סרט פרפין ולאחסן ב -20 ° C.
- באמצעות אותו הליך כמו לעיל, להכין פתרון מלאי של כימיה הבדיקה.
הערה: כימיות בדיקה רבות הן מאוד לאביליות, ועדיף שתמיסות יהיו טריות בכל פעם שהביו-אסאי מבוצע.
- הכינו דילולים סדרתיים של הבקרה החיובית ובדקו כימיות מתמיסות מלאי כפי שמוצג באיור 3 באמצעות בקבוקוני זכוכית של 20 מ"ל שנשטפו בעבר באצטון.
- לטהר מזרק זכוכית 1 מ"ל עם אצטון, למלא אצטון, ולאבטח את המוליך מיקרו מותאם לספק נפח של 0.25 μL.
- עבודה בקבוצות של עשרה, הוציאו נקבות יתושים בוגרות בנות 3 - 5 ימים מכלובים באמצעות שאיפה והרדימו עד חמש דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר או על קרח. לאחר מכן, מעבירים יתושים לצלחת פטרי ומניחים על קרח עד 10 דקות.
- עבודה מהירה, להסיר נקבה אחת עם פינצטה עדינה, ולמרוח 0.25 μL של תמיסת בדיקה על בית החזה הגבי באמצעות מיקרו מוליך מזרק. אשרו את העברת הכימיה על ידי תצפית באמצעות מיקרוסקופ מנתח כדי להבטיח שכל יתוש יקבל את הנפח המתאים של כימיית הבדיקה.
- העבירו את היתוש לכוס נייר מסומנת שנחה על קרח, וחזרו על הפעולה תשע פעמים כדי לקבל n = 10 יתושים מטופלים. אוטמים את היתושים בכוס עם ריבוע רשת מאובטח בגומייה, ומעבירים לגיגית פלסטיק או לתא גידול בתנאים קבועים של 28°C ו-75-85% לחות יחסית (במחזור של 12 שעות ביום / 12 שעות בלילה עדיף).
- חזור על הניסוי הנ"ל פעמיים כדי לקבל n = 3 שכפולים טכניים (כלומר, 30 יתושים בסך הכל) לכל טיפול או קבוצת ביקורת.
- חזור על שלבים 2.7 - 2.10 תחילה עם הכימיה של הבדיקה ולאחר מכן עם הבקרה החיובית.
הערה: אמצעי בקרה שימושי נוסף שיש לכלול אם יש מספיק יתושים זמינים הוא "ריק" של 30 יתושים מורדמים שאינם מקבלים כימיה בדיקה או ממס.
- תעד את מספר היתושים "מתים/לא מגיבים" ב-30 דקות, 60 דקות, 2, 24 ו-48 שעות לאחר החשיפה (או נקודות זמן חלופיות) באמצעות גיליון הניקוד (טבלה 1). ציון יתושים כ"מתים/לא מגיבים" אם הם מראים חוסר תנועה, המוגדר כשכיבה על צד אחד או על הגב ועם חוסר יכולת לעוף.
- אם תרצה, תקן עבור תמותה בקרה באמצעות הנוסחה של Abbott ששונתה כדלקמן:
תמותה (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
כאשר X = אחוז התמותה במדגם שטופל, ו- Y = אחוז התמותה בביקורת.
- הצג תוצאות כהיסטוגרמה או כעקומה מעריכית. עבור בדיקת מנה-תגובה, חשב את הערך LD50, LD75 או LD90 עבור הכימיה של הבדיקה ביחס לביקורת.
- חזור על הבדיקה לפחות פעמיים באמצעות קבוצות נפרדות של יתושים כדי לקבל n = 3 או יותר עותקים ביולוגיים.
