$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ייצור Lentivirus
הערה: הייצור והמניפולציה של וקטורים לנטי-ויראליים בוצעו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) למחקר המערב DNA רקומביננטי. נעשה שימוש בפלסמיד המקודד SOD1 מוטנטי מסוג פרא ו-A4V המתויג ב-YFP משופר (SOD1WT-YFP ו-SOD1A4V-YFP). שני תוצרי איחוי הגנים הוגברו באמצעות זוג פריימר PCR 5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGC-3′ ו-5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′והוחדרו לפלסמיד pTRIP-delta U3 CMV באמצעות אתרי הגבלה XhoI ו-BsrGI. הימנעות מיותר מ -20 מעברים ותחזוקה של תאים בפחות מ -60% מפגש מסייעת להבטיח יעילות טרנספקציה טובה.
- ביום הראשון, פיצלו תאי HEK-293T במפגש של 30 - 40% בצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ (3 x 10⁶ תאים לצלחת) ב-10 מ"ל של מדיום תרבית תאים (DMEM עתיר גלוקוז עם 10% FBS ו-4 מילימטר L-גלוטמין) לייצור וירוסים.
- שמור את צלחת תרבית הרקמה בקוטר 10 ס"מ באינקובטור CO₂ (37°C, 5% CO₂) למשך הלילה.
- ביום השני, הכינו תמיסת טרנספקציה של דנ"א המכילה 10 מיקרוגרם של וקטורים לנטי-ויראליים (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP או -SOD1A4V-YFP) יחד עם פלסמידים אריזה לנטי-ויראליים (5 מיקרוגרם של pVSVg; 10 מיקרוגרם של pCMV-dR8.71) (איור 1A). הוסף 125 μL של 1 M CaCl₂ וכוונן את הנפח ל 500 μL באמצעות מים מזוקקים. הוסיפו בעדינות 500 μL של 0.05 M HEPES לתערובת ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש להחליף תאי HEK-293T בינוניים בתרבית טרייה 10 מ"ל שחוממה מראש, ללא אנטיביוטיקה, מעורבבת בתמיסת טרנספקציה DNA של 1 מ"ל ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂.
- ביום השלישי, החליפו את הסופרנאטנט התא במדיום תרבית טרי.
- ביום 4, קצרו את הסופרנאטנט בצינור של 15 מ"ל ובצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 500 x גרם כדי להסיר את התאים המתים והפסולת. לטהר עוד יותר את supernatant על ידי העברת אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק גדול 60 מ"ל. יש לפזר מיד לתוך aliquots חד פעמי (300 μL), ולאחסן ב -80 ° C. כדי לשמור על פעילות מקסימלית של המוצר, הימנעו ממחזור הקפאה-הפשרה.
2. התמרה לנטיויראלית
- לפצל את קו התאים כדי להיות נגוע במפגש של 60% (תאי HEK-293 ו- SH-SY5Y; 5 x 10⁵ תאים לכל באר ו- U2OS; 1 x 10⁵ תאים לכל באר) בצלחת תרבית רקמה של 6 בארות ב -2 מ"ל של מדיה DMEM בתוספת 10% FBS.
- שמור את צלחת תרבית הרקמה 6 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב -5% CO₂ למשך הלילה.
- הסר את lentivirus קפוא מהמקפיא -80 ° C והפשיר aliquot על קרח לפני כל שימוש; אין להקפיא מחדש.
- בזמן שהנגיף מפשיר, חממו את מדיום תרבית התאים המכיל את הסרום התואם לקו העניין של התא. לאחר הפשרת הנגיף במלואו, הכינו מגוון דילולים (1:3, 1:10, 1:30 ו-1:100) ב-DMEM בצינור מיקרופוגה טרי של 1.5 מ"ל.
- העלה את נפח הצינורות ל -1 מ"ל עם מדיה מופחתת בסרום.
- הוסף 2 μL של פוליברן (במלאי של 4 מיקרוגרם / μL) ל 1 מ"ל של וירוס/מדיה. מערבבים היטב על ידי pipetting ולהוסיף 1 מ"ל של תערובת לתאים. לדגור על התאים עם הנגיף במשך 24 שעות.
- הסר את מדיית הווירוסים והחלף במדיית DMEM רגילה בתוספת 10% FBS. שמור על התאים ב 37 ° C, 5% CO₂.
- עקוב אחר צמיחת התאים ושנה את מדיית התרבית כל יומיים. במפגש, מרחיבים את צלחת 6 הבארות לצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ.
- לאחר שהתאים הורחבו מספיק, זרעו 1.5 x 10⁴ תאים לכל באר ב 50 μL של מדיה DMEM על לוחות בדיקה 384 באר כדי לבדוק את רמת הביטוי של חלבון YFP מתויג על ידי מיקרוסקופיה. אם ביטוי תא החלבון המתויג YFP מציג יחס אות לרעש ≥3, הכן את מלאי התאים לקו התאים המתאים.
3. השפעה תלוית זמן של מעכב פרוטאזום על צבירת חלבונים
הערה: בצע רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי (ראה חומרים).
- יש להוציא 0.25 μL של מעכב DMSO או פרוטאזום מומס ב-100% DMSO (ALLN, 2 mM) על לוחות תחתונים שטוחים של 384 בארות.
- זרע ידנית 1.5 x 104 תאים לכל באר ב 50 μL של מדיה DMEM על אותה צלחת בדיקה. הריכוז הסופי של מעכב פרוטאזום (ALLN) צריך להיות 10 מיקרומטר.
- הגדר את יחידת הבקרה הסביבתית של מערכת המיקרוסקופ ל- 37 ° C ו- 5% CO₂. צילום מסך של מערך הניסוי מוצג באיור 2.
- הפעל את המיקרוסקופ במצב פלואורסצנטי שדה רחב, באמצעות התוכנה עם ההגדרות הבאות: LWD 20X אובייקטיבי, מצב לא קונפוקלי, 4 שדות / באר, עם מרווח לכידה של שעה. בסוף כל ריצה, תמונות שצולמו מועלות אוטומטית לשרת.
4. הדמיית קיטועי זמן לביטוי YFP בתאים חיים, וניתוח תמונה (ערוץ יחיד)
הערה: השלבים הבאים מתארים את יישום התוכנה (לדוגמה, קולומבוס).
- בחר את האלגוריתם המתאים לפלח את האובייקטים העיקריים (ציטוזול וצברים). במידת הצורך, התאם את סף הרקע ואת פרמטרי הניגודיות (איור 3).
- ספירת תאים באמצעות 'חיפוש תאים' עם סף בודד של 0.1 עבור ערוץ עוצמת YFP. קבע צברים באמצעות אלגוריתם 'מצא כתמים' עם עוצמת ספוט YFP יחסית >0.2 ומקדם פיצול של 1.0.
5. השפעת תגובת מינון של מעכבי פרוטאזום על צבירת חלבונים על תאים חיים המוכתמים בגרעין שלהם (שני ערוצים)
הערה: בצע רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי. קבע את טווח הריכוז של מעכבי פרוטאזום (ALLN, Epoxomicin ו- MG132) בהתבסס על ערך IC50 הצפוי כדי להבטיח התאמה אופטימלית לעקומה.
- הכינו דילול סדרתי של תרכובות על צלחת פוליפרופילן לאחסון 384 בארות על ידי סדרת דילול סטנדרטית 1:3. הקפידו לערבב היטב את דילולי התרכובת כדי לוודא שריכוזי התרכובת מדויקים.
- יש להוציא 0.25 מיקרוליטר של מעכבי פרוטאזום על לוחות בדיקה שחורים ריקים בעלי תחתית שטוחה של 384 בארות. אנו משתמשים במטפל נוזלי המצויד בראש נימי 384 המסוגל להעביר נפחים.
- זרע 1.5 x 1010⁴ תאים לכל באר ב 50 μL של מדיה DMEM על לוחות בדיקה. לדגור על לוחות הבדיקה ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 24 שעות.
- יש להוסיף 10 μL של חומר DMEM (מחומם מראש ב-37°C) עם תמיסת צביעה (Hoechst 33342 במלאי של 10 מ"ג/מ"ל) ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- הפעל את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ. צילום מסך של מערך הניסוי מוצג באיור 4. בחר את הכרטיסייה "תצורה" ובחר מטרה 20X ואת סוג הצלחת הנכון. ודא ש"צווארון" מוגדר לערך הנכון על המטרה, ומאפשר מיקוד נכון עם סוגי לוחות שונים.
- בחר בכרטיסייה "מיקרוסקופ". הגדר חשיפה 1 כ- YFP (לייזר 488) וחשיפה 2 כ- Hoechst (לייזר 405). הפעילו את המסנן בשתי החשיפות והקצו חשיפה 1 למצלמה 1 וחשיפה 2 למצלמה 2. הגדר את זמני החשיפה ל~800 אלפיות השנייה לחשיפה 1 ול~40 אלפיות השנייה לחשיפה 2.
- בחר חשיפה 1. הגדר את גובה המיקוד ל- 0 מיקרומטר. בחר "מיקוד". לאחר המיקוד, חשוף את המצלמה 1. התאם את גובה המיקוד כדי לייעל את מישור החשיפה ולחץ על "קח גובה". שנה את זמני החשיפה ואת עוצמת הלייזר כדי לספק עוצמת פיקסלים מרבית של ~3,000. שמור פרמטרים של חשיפה. חוזרים על הפעולה לחשיפה 2.
- בחר בכרטיסייה "הגדרת ניסוי". צור פריסה ופריסת משנה. גרור ושחרר את הפריסה, החשיפה, תמונת ההפניה, קובץ ההטיה ופריסת המשנה הרלוונטיים. שמור את הניסוי.
- בחר בכרטיסייה "ניסוי אוטומטי" ורכוש תמונות. בסוף כל ריצה, תמונות שצולמו מועלות אוטומטית לשרת.
6. ניתוח תמונות של שני ערוצים
- בחר את אלגוריתם התוכנה כדי לפלח את האובייקטים העיקריים (גרעינים, ציטוזול וצברים) (איור 5).
- בחר את השיטה שמפלחת גרעינים במדויק על-ידי בדיקה חזותית של העצמים המקוטעים. עצמים מוכתמים ב-Hoechst בערוץ 1 (Ch1) ישמשו לקביעת מספר התאים. צביעת YFP מהמוטציה SOD1-A4V בערוץ 2 (Ch2) תשמש לקביעת כמות האגרגטים.
- ספירת תאים באמצעות אלגוריתם 'מציאת גרעינים' כאזורים צביעת הוכסט >20 מיקרומ"ר, עם מקדם פיצול של 7.0, סף בודד של 0.40 וניגוד >0.10.
- צור את טבלת הנתונים וקבע EC50 עבור כל אחת מהתרכובות באמצעות משוואת 'רגרסיה לא ליניארית' בתוכנת הגרפים.
