בדיקת פעילות אנדוטוקסין: בדיקה ביולוגית מבוססת כימילומינסנציה לחקר פעילות אנדוטוקסין בדגימת דם

תקציר

מקור: Pinciroli, R. et al. בדיקת פעילות אנדוטוקסין לאיתור אנדוטוקסמיה בדם מלא בחולים במצב קריטי. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים בדיקה ביולוגית מהירה לחקירת פעילות אנדוטוקסין בדגימת דם שלמה באמצעות שיטה מבוססת כימילומינסנציה. בדיקה זו היא בדיקת סמן ביולוגי מהירה ורגישה לאבחון בשלב מוקדם של אלח דם בתיווך אנדוטוקסין.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. בדיקת פעילות אנדוטוקסין (EAA)

1. איסוף דגימות דם של המטופל בצינורות סטריליים המכילים נוגדי קרישה מסוג EDTA. יש לאחסן דגימות דם בטמפרטורת החדר
2. הכן את מבחנות EA עבור דגימת הדם של כל מטופל שאתה צריך לבדוק. שים את הצינורות במדפי צינורות. לאחר מכן הסירו את הכובעים.
3. כל בדיקת EA מורכבת מ-5 סוגים שונים של צינורות; השתמש בכל אחד מהם עבור חלק אחר של הבדיקה (עיין בשלבים הבאים).
   1. השתמש בצינור #1 (צינור "בקרה") כדי למדוד את הפעילות הבסיסית של פרץ חמצוני לא ספציפי של נויטרופילים של המטופל בהיעדר נוגדן ספציפי.
   2. השתמש בצינור #2 (צינור "הדגימה") כדי למדוד את פרץ החמצון בתגובה לקומפלקס נוגדנים ליפופוליסכריד (LPS).
   3. השתמש בצינור #3 (צינור "מקס") כדי למדוד את פרץ החמצון המקסימלי של נויטרופילים של המטופל בתגובה לעודף של אנדוטוקסין.
   4. השתמש בצינור #4 (צינור "LPS") כמקור לאנדוטוקסין אקסוגני.
   5. השתמש בצינור #5 (צינור "Aliquot") לאחסון דם.
      הערה: כפילויות של צינורות #1, #2 ו- #3 מסופקות עבור סך של 8 צינורות שישמשו עבור כל דגימת דם נבדקת (בקבוק מגיב EA ובדיקת בקרת איכות ניתן להשתמש עבור כל הבדיקות הכלולות בשקית).
4. באמצעות קומבי-פיפטה, פיפטה נפח 1 מ"ל של מגיב EA מהבקבוק לתוך צינורות #1 (צינור בקרה), #2 (צינור דגימה), ו #3 (צינור מקס), כל אחד כפול.
   הערה: פיפטה במורד הצד של הצינור כדי למנוע פתרון ניתז בחזרה למעלה.
5. ערבבו את דגימת הדם של המטופל על ידי היפוך עדין של צינור איסוף הדם 20 פעמים. לאחר מכן, פיפטה 0.5 מ"ל של דם המטופל לתוך צינור #4 (צינור LPS max) וצינור #5 (צינור Aliquot). צינור מערבולת #4 עבור 10 שניות.
6. שים את מתלי הצינורות עם כל המבחנות של EA בשייקר האינקובטור. סגרו את המכסה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C.
7. פתח את המכסה והסר את מתלי הצינור משייקר האינקובטור. צינור מערבולת #5 (צינור Aliquot). באמצעות קצה סטרילי, פיפטה 40 μL של דם לתוך צינורות #1 ו #2, כפול.
8. צינור מערבולת #4 (צינור LPS). באמצעות אותו קצה פיפטה, פיפטה 40 μL של דם מצינור #4 לתוך צינור #3 (צינור מקסימלי), בכפול.
9. מערבול את שש המבחנות הסופיות (#1, #2, #3, וכפילויות בהתאמה), ולאחר מכן החזיר אותן למדפים שלהן.
   הערה: ודא שכל הצינורות מעורבבים למשך אותה כמות זמן.
10. החזירו את מתלי הצינור לשייקר הדגירה וסגרו את המכסה. כוונו את שייקר הדגירה ל-100 סל"ד, ואז התחילו את התנועה למשך 14 דקות.
11. הכנס את כרטיס השבב המסומן ב- EA ל- chemiluminometer ולחץ על התחל. לאחר הדגירה של 14 דקות, בצע את ההוראות המוצגות על הכימילומנומטר כדי לקרוא את צינורות EA בסדר הנכון.
12. מערבלים בעדינות כל צינור במשך 10 שניות לפני הצבתו על מחזיק הדגימה של הכימילומינומטר. פתח את מגירת הדגימה והנח את הצינור #1 במחזיק הדגימה. לאחר מכן, סגור את מגירת הדגימות והמתן לקריאת יחידת האור היחסי (RLU).
13. חזור על שלב 1.12 עבור צינור 2 וצינור 3.
14. חזור על שלב 1.12 עבור שפופרות כפולות 1, 2 ו- 3.
    הערה: נסה לערבל את כל הצינורות במשך אותה כמות זמן במהלך שלבים 1.12-1.14.
15. לאחר שכל הצינורות עובדו, שים לב שתוצאות EA יחושבו ויודפסו באופן אוטומטי. רמות מבוטאות כיחידות EA ומייצגות את הממוצע של קביעות כפולות מאותן דגימות.
16. חזור על שלבים 1.4 עד 1.15 עבור כל דגימת דם שיש לבדוק.
17. לאחר השלמת הבדיקה, אחסן את המבחנות הנותרות ואת ריאגנטים EA ב 2-8 ° C למשך עד 30 ימים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת EAA	ספקטרל מדיקל בע"מ	EAAST-20	חבילה עם 20 בדיקות + בקרת איכות אחת
קו חכם TL	ברתיולד	EAASL	לומינומטר
שייקר אינקובטור	גרנט	ES-20	מיני שייקר אינקובטור
וורטקסר	VWR	444-2790	מכשיר מערבולת